2018 Fiscal Year Research-status Report
Exhaustive analysis for substrate recognition mechanisms of the carbohydrate binding module proteins
| Project/Area Number |
17K00409
|
|---|
| Research Institution | University of Miyazaki |
|---|
Principal Investigator |
湯井 敏文 宮崎大学, 工学部, 教授 (50230610)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇都 卓也 宮崎大学, テニュアトラック推進機構, 助教 (60749084)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 糖結合モジュール / ドッキングシミュレーション / 操舵分子動力学法 / キチン / キチナーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
孤立分子鎖または結晶状態のセルロースやキチン糖鎖基質と可逆的（非触媒的）に結合する糖結合モジュール（CBM）タンパク質を対象とした。CBMは触媒能力を持たないが、触媒ドメインの基質に対するアクセシビリティを向上させる。酵素本体（触媒ドメイン）に基質が活性部位に結合した複合体の場合、結晶構造解析対象となることが多いが、可逆的かつ多様な結合状態が予想されるCBM-糖鎖複合体の結晶構造解析研究例は限られている。本研究は、コンピュータによる分子シミュレーションを手段として、CBMの基質認識機構を明らかにすることを目的とした。
CBMは糖鎖に対する結合様式によって、主に不溶・結晶状態の糖鎖に対してCBM表面が認識する様式（Type A）、CBM表面の浅いクレフト上で孤立糖鎖を認識する様式（Type B）、および糖１～２残基程度の糖鎖部分に対してCBM表面が認識する様式（Type C）に分類される。これらの三つの結合様式に対応する複数のCBMをモデル系として選択し、それらCBMと糖鎖基質の複合体構造モデル群を網羅的に求める。得られた複合体モデル群のシミュレーション計算を実施し、基質認識に関わる熱力学量や立体構造を解析する。さらに、CBM表面に対する糖鎖基質の結合・脱離過程や結合クレフト上の基質移動過程等のより大きな構造変化を伴う基質認識過程を、分子シミュレーション計算によって再現する。以上の知見から、CBMが示す可逆的かつ多様な糖鎖基質認識機構の空間的・時間的な全体像を明らかにする。
一般に、糖加水分解酵素（セルラーゼ、キチナーゼ等）は、CBMを失うと触媒活性を大きく低下する。本研究の成果は、酵素全体の反応機構に理解に貢献することに加え、加水分解活性や基質認識特性を制御する変異CBM設計へと展開することが期待される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．Pyrococcus furiosus由来の高耐熱性キチナーゼ Pf-ChiA, キチン結合モジュールの基質認識
Pf-ChiAのキチン結合モジュールChBD2はTypeAのCBMに相当し、基質結合面に３つの基質認識芳香族アミノ酸（W274、W308とW326)が配置する。昨年、ChBD2とキチン４量体（GlcNAc4）を対象としたドッキングシミュレーション計算を実施し、GlcNAc4が基質認識表面に可逆的に結合する挙動を観察した。今回、キチン分子鎖（DP=20）上にChBD2を配置し、操舵分子動力学（Steered Molecular Dynamics, SMD）計算を適用し、キチン分子鎖上におけるChBD2の移動に要する自由エネルギー量を評価した。その結果、ChBD2は酵素の加水分解方向と一致する方向に、より少ない自由エネルギー量で移動することが示された。
2. Hevea brasiliensis由来の抗真菌性ペプチドHeveinの基質認識
ヘベインペプチドはType Cに分類され、3個の芳香族アミノ酸残基（W21、W23、Y30）がキチン糖鎖と結合する複合体立体構造がNMR測定によって報告されている。昨年、ヘベインとGlcNAc3を対象としたシミュレーション計算を実施し、キチン糖鎖が基質認識Trp残基に、NMR構造の方向と一致する結合方向に不可逆的に結合する結果を得た。今回、同様なドッキングシミュレーション計算を、主に基質認識に関わるアミノ酸に変異を導入した７種の変異ヘベインに適用した。別の芳香族アミノ酸への変異導入は、結合エネルギーに変化を与えるにとどまり、結合様式に大きな変化をもたらさなかった。水素結合形成に関わるとされるY30とS19に対するアラニン変異も、実質的に野生型を同じ結合様式を与えた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）力場パラメータの改良； Heveinのドッキングシミュレーション計算では、恒常的に基質認識アミノ酸にキチン基質が結合し、分子鎖方向も常にNMR構造を一致することが示されたが、厳密には、NMR構造（サブサイト+3~+1)と比較して基質は残基１個分ずれた位置（+2~-1）に結合した。さらに、残基２個ずれた位置（+1～-2）に不可逆的に結合する結果も得られた。このことは、芳香族側鎖と糖ピラノース環同志の非結合相互作用が過剰に評価され、溶媒和相互作用とのバランスが適当でなかったと推定される。今後、関連する非結合相互作用のパラメータを改良し、NMR構造を再現する、より精密なシミュレーション計算を目指す。
２）SMD計算の精密化； SMD計算は、反応座標の設定、印加する外力の大きさや移動速度等、いくつかの条件を設定する必要がある。今回、ChBD2とキチン分子鎖を対象とした計算は、試験的なもので、今後、以上の計算条件をさらに吟味し、より定量性を向上させたSMD計算を実施し、ChBD2移動に要する熱力学量をより高い精度で評価する必要がある。
３）Type B CBMのドッキングシミュレーション計算； 研究期間１年目よりType B CBMに相当するClostridium cellulovans とClostridium josuiエンドグルカナーゼCBMを対象とする計算を試みたが、糖鎖が異なる様式で結合した複数のCBM-糖鎖複合体モデルを構築することに成功していない。今後、初期構造発生のための専用プログラムを作成し、反応座標に沿った複合体モデル群を構築し、アンブレラ計算法の適用によって、CBM糖鎖結合クレフトに沿った糖鎖移動に要する自由エネルギー量評価を試みる。
|
