2018 Fiscal Year Research-status Report
Construction of basic technique using multifunctional protein for periodontal disease treatment
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17K01944
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
落合 秋人 新潟大学, 自然科学系, 助教 (40588266)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 抗真菌 / 抗炎症 / ディフェンシン / α-アミラーゼ / イネ / 歯周病治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、ヒト由来α-アミラーゼHsAmyおよびイネ由来ディフェンシンOsAFP1が細菌内毒素と結合することを見出した。また、OsAFP1は歯周病の重症化に関与する日和見感染真菌に対して強い抗真菌活性を示す。本研究においては、[1] HsAmyおよびOsAFP1の内毒素結合メカニズムの解析とin vitroにおける抗炎症作用を検証し、[2] OsAFP1の抗真菌作用メカニズムの解明を行う。これにより、天然物由来の素材を利用した新たな歯周病治療法を開発するための基盤技術の構築を目指す。研究計画２年目において、以下に挙げる成果を得た。
[1] HsAmyおよびOsAFP1の内毒素結合メカニズムの解析とin vitroにおける抗炎症作用の検証……昨年度から、ヒトHEK293細胞を利用して組換えHsAmyの大量生産を進めている。本年度は、細胞外への分泌シグナル配列を付加して発現系を構築した。その結果、250 mLの細胞培養液から約5mg程度の可溶性タンパク質を得ることができた。また、質量分析や内毒素結合能の解析により、天然型HsAmyと同等の性質を有することを明らかにした。
[2] OsAFP1の抗真菌作用メカニズムの解明……過去の解析から、OsAFP1のN末端およびC末端の10残基程度のアミノ酸配列が抗真菌活性に関わることが示唆されている。そこでこれらの領域内のアミノ酸残基を置換した変異体を12種類設計し、抗真菌活性を測定した。特に、R1, H2, L4, R9, F10, L39, およびR41における変異体の活性が顕著に低下したことから、OsAFP1におけるこれらの領域が抗菌活性に直接的に関与することを示した。また、OsAFP1におけるそれら残基の役割をより詳細に明らかにするためにX線結晶構造解析を進めており、既に3オングストローム分解能程度までの回折データを取得している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した研究計画[2] OsAFP1の抗真菌作用メカニズムの解明について、12種類の変異体を設計して解析することにより抗真菌活性に関与するアミノ酸残基を特定した。これらのアミノ酸残基の特定は、ターゲット分子との相互作用などに関係していると考えられ、メカニズムの解明に向けての大きな進捗である。また、当研究計画の進捗が想定以上であることから、これら残基の役割を詳細に明らかにするためにX線結晶構造解析を進めている。一方、研究計画[1] HsAmyおよびOsAFP1の内毒素結合メカニズムの解析とin vitroにおける抗炎症作用の検証について、当初の予定からやや予定から遅れたものの、ヒトHEK細胞を利用して可溶性組換えHsAmyの大量生産に成功した。今後は、抗炎症作用の解析が飛躍的に進展すると期待できる。これら成果の一部は、原著論文として発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画[1]においてHsAmyの大量生産に成功したことから、今後は部位特異的変異体を設計して解析することにより、HsAmyの抗炎症活性に関わる構造要因の解明を加速度的に進める。また、研究計画[2]においては、膜脂質との結合性を解析するPIP Plateなどを用いて細胞壁内のターゲット分子の特定を進めており、既にOsAFP1が細胞膜由来の特定の脂質成分に結合する可能性を示す結果を得ている。今後は分子間相互作用解析などを用いてその詳細を明らかにしていく。また、抗真菌活性に関与するOsAFP1の特定のアミノ酸残基の具体的な役割を、X線結晶構造解析により明らかにする。OsAFP1の立体構造は不明であることから、そのＸ線結晶構造解析は、OsAFP1の機能解析に様々な有益な情報を与えてくれると考えられる。
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| Causes of Carryover |
【理由】
研究計画[2]が想定以上に進捗していることから、予算計上した一部消耗品が不要になった結果、次年度繰越額が生じた。この繰越額は、次年度に投稿予定の原著論文の英文校正費および掲載費、さらには一部機器の故障修理費にも充当する予定である。このように、次年度における残額の使用計画は立っており、ほぼ予定通りに執行されている。
【使用計画】
最終年度は、上記使用計画のほか、ターゲット分子の同定に使用する膜成分の購入、微生物やヒトHEK細胞の培養に使用する器具・試薬、および変異体タンパク質の作製に使用するDNA関連試薬などの購入に充てる。また、X線結晶構造解析に必要な器具・試薬、およびX線回折データの取得のため、大型放射光施設への旅費などにも充てる予定である。
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