2018 Fiscal Year Research-status Report
１９F-NMR法と常磁性効果を用いた細胞内環境下のタンパク質の基質認識機構の解明
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17K07298
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小柴 生造 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (70332301)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 19F-NMR / In-Cell NMR / 動的構造 / Keap1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。本研究の平成３０年度の成果
は以下の通りである。
本研究計画で解析するタンパク質のうち、多数の基質を選択的に認識する酸化ストレス応答タンパク質Keap1について、基質である転写因子Nrf2の相互作用をNMRで高次構造レベルで詳細な解析を行うとともに、別のタンパク質との相互作用に伴う構造変化についても詳細な解析を実施した。さらに別の種類の基質である各種低分子（親電子性物質）とKeap1の相互作用について、特にシステイン残基への結合に伴うKeap1やNrf2の構造変化や、Nrf2とKeap1の相互作用に親電子性物質が与える影響をNMRを用いて高次構造レベルで解析を実施した。一方、ドメイン間の構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により解析するために、３つのドメインから構成されるアミノ酸代謝酵素phenylalanine hydroxylase (PAH)や、異なるドメイン構成を持つ別の代謝酵素ASPGについても大量発現・精製を行い解析を進めている。今後は遠距離の情報が得られる常磁性効果を利用してドメイン間の距離情報を得る方法を上記３種類の解析対象に適応し、ドメイン間の構造変化を解析するとともに、細胞内における構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により詳細に解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。
平成３０年度には、本研究計画で解析する各タンパク質のNMR測定を実施し、Keap1-Nrf2経路では実際に基質認識に伴う高次構造変化について詳細な解析を実施した。また19F標識を含む各種安定同位体標識の条件を検討し、本研究の目標であるin vivo環境下での動的構造変化の解析への応用を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構の解明に向けて、平成３０年度に基質認識に伴う高次構造変化等の解析を実施した各タンパク質について、各種19F標識技術や19F-NMR計測技術を中心に適宜最新の計測技術を組み合わせることで細胞内での解析を進める。特に基質結合に伴い大規模な構造変化が起こることが想定されているKeap1-Nrf2複合体を引き続き重点的に解析するとともに、新たに常磁性効果を用いた遠位距離情報の解析を組み合わせることで、ドメイン間の構造変化を詳細に解析する。さらに細胞内において同様にNMR解析を進めin vivo環境下での動的構造変化の解明をめざす。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では平成３０年度に各種19F標識アミノ酸を含む様々な安定同位体標識タンパク質を合成して基質認識に伴う高次構造変化の解析や細胞内環境下における構造変化の解析を行う予定だった。これまでに各種タンパク質について安定同位体標識を行い、基質認識に伴う構造変化について解析を進めてきた。しかし装置の使用時間の制限等の為、19F標識タンパク質を用いた細胞内におけるタンパク質の動的構造解析の解析に時間がかかっており、次年度に19F標識を含めた安定同位体標識タンパク質の大量合成やNMR測定等実験の一部を繰り越す必要が生じたため、次年度使用額が発生した。
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