2019 Fiscal Year Research-status Report
１９F-NMR法と常磁性効果を用いた細胞内環境下のタンパク質の基質認識機構の解明
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17K07298
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小柴 生造 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (70332301)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | In-Cell NMR / 19F-NMR / 動的構造 / Keap1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。本研究の令和元年度の成果は以下の通りである。
細胞内で様々な酸化ストレスに対応して機能する酸化ストレス応答タンパク質Keap1について基質である転写因子Nrf2の相互作用をNMRで高次構造レベルで詳細な解析を行うとともに、Keap1とNrf2の相互作用を阻害する複数の新規化合物についてその相互作用機構をin vitroで詳細に解析を行った。また昨年度に引き続き、Keap1のもう一つの基質である各種親電子性物質（化合物）とKeap1の相互作用について、特にシステイン残基への結合に伴うKeap1やNrf2の構造変化や、Nrf2とKeap1の相互作用に親電子性物質が与える影響を各種NMR法を用いて詳細な解析を実施した。
一方、ドメイン間の構造変化の解析のために、マルチドメインタンパク質である各種代謝酵素（PAH,ASPG等）についても引き続き大量発現、精製を進めて解析を行っている。今後は最終的な目標である細胞内環境下における分子認識機構の解析法の確立に向けて、これまで解析したKeap1等のタンパク質について細胞内に高効率に導入し、ドメイン間の構造変化を各種19F-NMR法や常磁性効果を組み合わせることにより解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。
現在までの状況では、各種マルチドメインタンパク質についてin vitroで分子認識や動的構造変化のNMR解析を行い、その詳細なメカニズムを明らかにしてきた。しかし細胞内への目的タンパク質の高効率な導入を安定して実施するのに時間がかかっており、細胞内環境下での解析が遅れている。今後は細胞内への導入法を最適化することでin vivo環境下での動的構造変化の解析を行うとともに、平行して他のタンパク質についてもin vivoでの解析を検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで解析した各種タンパク質を細胞内に導入し、19F-NMR計測技術を中心に適宜最新の計測技術を組み合わせることで細胞内での解析を進める。導入に際しては様々な方法を検討するとともに細胞の種類についてもさらに検討を進め効率的な導入を目指す。また平行してin vitroでの解析も進め、各種19F-NMR法や常磁性効果を用いたマルチドメインタンパク質の高次構造変化の解析方法の開発も並行して実施するととともに、他の分析手法も組み合わせて効率的な解析法を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では平成３１年度に基質認識に伴う高次構造変化の解析や細胞内環境下における構造変化の解析を行うため、これまでに各種タンパク質について基質認識に伴う構造変化について解析を進めてきた。しかし装置の使用時間の制限や細胞への導入法の再検討等の為、各種標識タンパク質を用いた細胞内におけるタンパク質の動的構造解析の解析に時間がかかっており、次年度に安定同位体標識タンパク質の大量合成やNMR測定等実験の一部を繰り越す必要が生じたため、次年度使用額が発生した。
次年度には各種安定同位体標識タンパク質を大量合成して細胞内に導入しNMR測定を行うことで細胞内におけるタンパク質の動的構造解析の解析を進める．その際の各種安定同位体標識タンパク質の合成費用や細胞培養費，さらにNMR試料管や測定費用などに助成金を使用する．
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