2018 Fiscal Year Research-status Report
凝集誘起発光イメージングで「観る」プリオンタンパク質オリゴマーの形成・伝播機構
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17K07315
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
山本 典史 千葉工業大学, 工学部, 准教授 (30452163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島崎 俊明 千葉工業大学, 工学部, 准教授 (10452476) [Withdrawn]
鎌足 雄司 岐阜大学, 研究推進・社会連携機構, 助教 (70342772)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 凝集誘起発光 / アミロイド / プリオン病 / イメージング / アルツハイマー病 / シミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プリオン病はプリオンタンパク質（PrP）が異常重合し脳内に凝集体が蓄積することで発症するが，その感染・発症機構は不明である．従来，多数のPrPが凝集したアミロイド線維の沈着が病態の中心だと考えられてきたが，近年，少数のPrPが重合したオリゴマーがより強い細胞毒性と感染性を持ち，プリオン病病態機序で中心的な役割を果たすという説が有力である．しかし従来の方法ではPrPオリゴマーを可視化することはできない．本研究では，PrPオリゴマーの動態を生き た細胞内で「観る」ため，抗プリオン化合物と凝集誘起発光（Aggregation Induced Emission; AIE）色素を融合した新しい蛍光プローブを開発し，AIEイメージ ングを用いてプリオン病とPrPオリゴマーの因果関係を解析する．本研究で得られる成果はプリオン病の診断・治療法開発への貢献が期待できる. 本研究はAIE現象を利用してタンパク質凝集体の分子イメージング技術を確立するものであり，AIEメカニズムの理解が不可欠である．平成30年度は，昨年度に引き続き，タンパク質凝集体の分子イメージング技術を確立するための基礎として，最も代表的なAIE分子であるシアノスチルベン誘導体CN-MBEおよびテトラフェニルエチレンTPEの発光メカニズムについて，分子シミュレーションを用いた理論的解析に取り組んだ．その結果，これまで不明であったCN-MBEとTPEのAIEメカニズムを明らかにし，AIE現象を利用した分子設計をおこなうための基礎を確立することに成功した．そこで，CN-MBEとTPEのAIEメカニズムの解析結果に基づき，「PrPを特異的に標識する選択的結合性」と「結合したタンパク質同士が凝集する場合にのみ蛍光性がオンとなる凝集誘起発光性」を併せ持つPrP 凝集体プローブのパイロットモデル分子を合成し，物性評価をおこなった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は，昨年度に引き続き，抗プリオン剤とAIE色素を融合したPrP凝集体プローブを設計・合成し，AIE特性の検証，PrPとの相互作用解析をおこなうことを目的とした．タンパク質凝集体の分子イメージング技術を確立するための基礎として，最も代表的なAIE分子であるシアノスチルベン誘導体CN-MBEとテトラフェニルエチレンTPEの発光メカニズムについて，分子シミュレーションを用いた理論的解析に取り組んだ．その結果，これまで不明であったCN-MBEとTPEのAIEメカニズムを明らかにし，AIE現象を利用した分子設計をおこなうための基礎を確立することに成功した．CN-MBEとTPEのAIEメカニズムの解析結果に基づき，PrP凝集体プローブのパイロットモデル分子TPE-Trehaを合成し，基本物性の評価をおこなった．TPE-TrehaをTHFと水の混合溶液中に溶解し，THF/水の割合を変化させながら蛍光測定をおこなった。その結果，TPE-Trehaは，水の割合が少なく（THFの割合が大きく）溶液中に分散しているときには蛍光を示さないが，水の割合が大きく（THFの割合が少なく）溶液中で凝集して微粒子を形成しているときには強く発光することが明らかになった．つまり，TPE-Trehaは顕著なAIE特性を示すことが明らかになった．このTPE-Trehaを細胞中に添加し蛍光顕微鏡観察をおこなったところ，死細胞のみが蛍光を示し，選択的にイメージングできることが明らかになった．現在，TPE-TrehaとPrPの相互作用解析，および，PrP凝集体にTPE-Trehaを添加したときの蛍光測定について準備を進めている状況である．以上の進捗状況から，本研究はおおむね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は，昨年度に引き続き，「PrPを特異的に標識する（他の生体分子には結合しない・結合しにくい）選択的結合性」と「結合したタンパク質同士が凝集する場合にのみ蛍光性がオンとなる凝集誘起発光性」を併せ持つPrP凝集体プローブのTPE-Trehaを合成し，水・THF混合溶液中における蛍光測定など，AIE特性についての物性評価をおこなった．その結果，TPE-Trehaは水・THF混合溶液中において顕著なAIE特性を示すことから，PrP凝集体を選択的・高感度に分子イメージングするための蛍光プローブとして有望なシードであることが検証実験により明らかになった．今後，昨年度中に設計したGN8-AIEとあわせて，凝集体プローブとしてのPrP結合能・AIE特性を向上させるための最適化に取り組む．GN8-AIEおよびTPE-Trehaを用いて確立したAIEイメージング技術を用いてPrPオリゴマーの蛍光測定をおこない，その動態を明らかにする予定である．さらに，PrPオリゴマーの構造をモデル化し，分子シミュレーションをおこなうことで，その形成・伝播の詳細なメカニズムを分子レベルでも明らかにする予定である．
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| Causes of Carryover |
平成30年度の予算案では，シード化合物の有機合成のための費用および実験補助のアルバイト費用を主に計上していたが，昨年度と同様に，効率的な合成経路を開拓することに成功したことで，当初の計画に比べて低コスト・短時間に目的化合物を合成することが可能となり，次年度使用額が生じることとなった．平成30年度に開発したシード化合物の場合，PrPへの選択的結合性が低いため，今後，この性質を向上させるための最適化が課題となる．令和元年度は本研究目的を達成するためにこのシード化合物の最適化を計画しており，設計・合成・検証・相互作用解析のための費用が当初の予算案を超過すると考えられることから，上記未使用分を合わせた予算計画として再検討することで，効率的に研究を遂行することを予定している．
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