2019 Fiscal Year Research-status Report
プロトン駆動力を用いたSecDFによるタンパク質膜透過促進機構の解明
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17K07334
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森 博幸 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (10243271)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | SecDF / PMF / タンパク質膜透過 / 細菌 / 分泌 / PpiD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌のタンパク質の膜透過には、進化的に高度に保存された膜透過チャネルSecYEGトランスロコン、必須の駆動モーターSecA ATPase、膜タンパク質複合体SecDFが中心的な役割を果たす。我々はSecDFの構造機能解析を通して以下の作業仮説を提案している。即ち、「膜を挟んで形成されたPMF（プロトン駆動力）エネルギーを利用して、SecDFは、プロトンの流入と共役して自身の構造変化を起こし、それが膜外ドメインの更なる構造解析を誘起し、膜透過途上の基質タンパク質を補足し引っ張り出す。」というものである。本研究では、この作業仮説を検証することにより詳細な分子機構の解明を目指す。具体的には、１）SecDF分子内のプロトン透過経路の決定、２）基質結合部位の道程、３）プロトン透過と基質タンパク質の動きの共役機構の解明の３点が主要な問題となる。一昨年度は、NAISTの塚崎博士達との共同研究により、SecDFの異なる結晶構造を解明し、その構造情報から、プロトンの透過経路と基質結合部位に関して新たなモデルを提唱することができた。昨年度は、プロトン透過とSecDの細胞外ドメインの構造変化の共役を部位特異的in vivo光架橋法を用いて検討した。その結果、プロトン透過能と細胞外ドメインの構造変化の間には密接な関係があることを示すデータを得た。本年度は、SecD の細胞外ドメインを対象としたin vivo光架橋実験を更に進め、新たな因子PpiDとの架橋を明らかとした。また、PpiDはSecDFと共同的に機能することで、ある種の基質タンパク質の膜透過を促進する能力を持つことを示した。PpiDによるSecDF機能亢進の分子機構の解明を視野に入れ、本研究を１年延長することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
プロトン流入と共役したSecDのP１ドメインの構造変化の実態を、部位特異的in vivo光架橋法を用いた分子内架橋形成の効率の変化を指標にして解析を進めて来た。プロトン流入に必須のアミノ酸残基への変異導入や、PMFの消失を促すCCCP処理により、架橋形成効率が著しく低下するなどの結果を得ており、作業仮説を概ね上手く説明できると考えている。本年度は、SecD分子内の可動ドメインP1領域を対象とした部位特異的in vivo光架橋実験を行い、これまで想定していなかったペリプラズムに大きなドメインを持つ膜アンカー型の分子シャペロンPpiDとの架橋形成を確認した。また、遺伝学的な解析結果から、PpiDはSecDFと共同的に働くことで、ある種の基質タンパク質の膜透過を促進していることが明らかとなった。これらは全く新規な成果であり、SecDFの機能を理解する上でブレイクスルーとなると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画では本年が最終年度ではあったが、新たに見出したPpiDの役割を明らかにする事を目指して、研究期間を１年延長し以下の研究を進める予定である。
１）PpiDのペリプラズム領域をターゲットとした網羅的なin vivo光架橋実験を進め、PpiD分子内のSecD近接部位を明らかにする。２）PpiDと安定な複合体を形成する因子としてYfgMが知られている。SecD-PpiD間相互作用におけるYfgMの寄与を欠失変異体を作成することにより評価する。３）PpiDとYfgM間の相互作用様式についても、網羅的なin vivo光架橋実験により解析する。４）SecD-PpiD間相互作用とPMFとの関係を明らかにする目的で、架橋形成におけるプロトンイオノフォアCCCPの効果を検討する。また、SecDFのプロトン透過に必須なアミノ酸残基の変異体を用いて同様の光架橋実験を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究の比較的早い段階で、SecDFの機能発現に関与する新たな因子PpiDを見出した。しかしながら、この因子の役割を解明するには、本年度の残りの期間だけでは不十分であるため、より詳細な分子機構の解明を目指して１年間の研究期間の延長を申請した。延長期間中に行う実験に必要な研究費を確保する目的で、本年度の研究費の使用を少し抑え、次年度に繰り越すこととした。新しく研究室に加わった大学院生にも本計画に参加してもらうことで、効率よく研究を進めたいと考えている。
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[Journal Article] Tree of motility;A proposed history of motility systems in the tree of life2020
Author(s)
M Miyata, R C Robinson, T QP Uyeda, Y Fukumori, S Fukushima, S Haruta, M Homma, K Inaba, M Ito, C Kaito, K Kato, TKenri, Y Kinosita, S Kojima, T Minamino, H Mori, S Nakamura, D Nakane, K Nakayama, M Nishiyama, S Shibata, K Shimabukuro, M Tamakoshi, A Taoka, Y Tashiro, ITulum, HiWada, K Wakabayashi
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Journal Title
Genes to Cells
Volume: 25
Pages: 6-21
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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