2018 Fiscal Year Research-status Report
CRISPRライブラリーを用いたグルコシルセラミドの脂質二重膜間輸送因子の探索
| Project/Area Number |
17K07357
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
|---|
Principal Investigator |
山地 俊之 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (50332309)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | スフィンゴ糖脂質 / ゲノム編集 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳動物細胞のスフィンゴ糖脂質の生合成酵素はほぼ同定されている。しかし細胞内輸送因子に関しては未解明な点があり、その中で最も解明が注目されている輸送として、グルコシルセラミド (GlcCer) の脂質二重膜を横切る輸送（フリップフロップ機構）が挙げられる。GlcCerは合成酵素によって主にゴルジ体の細胞質側で生合成される。続いて生合成されるラクトシルセラミド (LacCer) の合成酵素はゴルジ体内腔側に活性部位を有しているため、GlcCerは細胞質側から内腔側へフロップする必要がある。本研究は、この未解明である糖脂質生合成に必須であるGlcCerのフロップ機構に関与する因子の同定を目的とする。H30年度は、以前ゲノムワイドスクリーニングで同定された糖脂質代謝関連因子群の解析を行った。その中で複数回膜貫通タンパクのTM9SF2及びLAPTM4Aは、HeLa細胞において遺伝子ノックアウトにより糖脂質Gb3の顕著な低下を示した。ただし糖脂質発現パターンの詳細をみると、Gb3の低下の代わりに前駆体であるLacCerが蓄積し、GlcCerはそれほど変化が見られなかった。このことから、これらのタンパクがフロッパーゼである可能性は低いと考えている。新たな探索方法として遺伝子発現増強型ゲノムワイドスクリーニング法の構築を行った。Huh7細胞においては系の構築に成功したものの、志賀毒素をスクリーニングに用いることの出来るHeLa細胞では残念ながら構築に至っていない。一方スフィンゴ糖脂質の挙動を見やすくするために、スフィンゴ脂質の多くを占めるスフィンゴミエリンの合成酵素1及び２の二重破壊株を作成した。この細胞を用いることで、蛍光セラミドのパルスラベルによる糖脂質の動態の追跡が容易になった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初目的の遺伝子を単離するため、遺伝子発現増強型CRISPRライブラリーを用いた新たなスクリーニング法の構築を試みたが、HeLa細胞において網羅的な遺伝子の発現増強細胞群を作製することが出来なかった。現在原因を検討中である。ただし上記の通り、スフィンゴミエリンの合成酵素1及び２の二重破壊株を作成したことにより、糖脂質の挙動をよりクリアに追跡出来る土台が出来た。
|
| Strategy for Future Research Activity |
H31年度は以下のアプローチをとる。
GlcCerからLacCerのステップに特化して追跡できるように、上記のスフィンゴミエリン合成酵素1及び2の二重破壊株に、ガラクトシルセラミド合成酵素、及びGb3合成酵素を破壊した四重破壊株細胞を作製し、GlcCerからLacCerへの生合成ステップを蛍光セラミド及び放射性ラベル実験でクリアに追跡出来る系を構築する。この系を用いて、1. フロッパーゼの候補になりそうな遺伝子を個々に破壊し、生合成への影響を見る。2. これらの細胞を用いた、新たなゲノムワイドスクリーニング系を構築する。
|
| Causes of Carryover |
H30年度は年度をまたいで、GlcCer合成酵素をはじめとする数種類の糖脂質代謝関連タンパクの抗体を受託作成しているため、見かけ上次年度使用額が生じている。
H31年度は、通常の分子生物学的試薬、細胞培養試薬の他、パルスラベル用放射性物質の購入が必要となるため生化学用試薬等の購入を計画している。また学会参加に関しては国内２回、海外1回の予定である。
|
Research Products
(5 results)
