2018 Fiscal Year Research-status Report
Transmission mechanism of positional information to living tissue by fluid flow.
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17K07425
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
野中 茂紀 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 准教授 (90435529)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 繊毛 / 左右非対称性 / 発生学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類発生の左右決定においては胚表面のノードと呼ばれる部位において繊毛が作る左向きの水流が決定的に重要である。回転する繊毛が作る水流はノードの左右周縁部にある細胞自身によって検知され、細胞内Ca2+上昇(以下「発火」)が左側でより頻繁になる左右差を引き起こし、これがさらに遺伝子発現の左右差につながると考えられている。しかしノードの細胞が水流を検知する機構は未だ不明である。
現在までに提唱されている仮説として「膜小胞を通じ分泌された物質が濃度勾配をつくる(NVPモデル)」と「水流のずり応力が情報を伝える(ずり応力モデル)」の2つがある。前者はそれらしい映像が捉えられているものの時間解像度が不足しており、後者はノードの左右端で流速が違うことが前提となるが、哺乳類胚でこれをきちんと計測した例はない。
そこで両モデルを検証するために、電気的可変焦点レンズ（ETL）を利用した自作の高速・振動フリーの光シート顕微鏡を用い、生きたマウス胚のノードを観察している。NVPモデル検証のためには細胞表面を蛍光ラベルし、報告されているような粒子の有無を調べている。ずり応力モデル検証のためには蛍光マイクロビーズで可視化した水流の速度分布を調べている。いずれもはっきりした結果は得られておらず解析を続けている段階である。また水流によって生じると考えられる微小な電位（流動電位）が左右性決定に関わる可能性を検証するため、電位の測定及び強制的に胚に印加するシステムの構築に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
自作の光シート顕微鏡に電気的可変焦点レンズ(ETL)を組み込み、最大約10 volume/secで立体像を撮影でき、かつ機械的振動を排した光シート顕微鏡を構築し以下の実験を行った。
NVPモデル検証のため、十分な明るさを得るため蛍光タンパク質ではなく外から蛍光染色色素を添加して細胞表面を染めた胚を用いて観察した。今のところNVPとして報告されているような粒子は観察されていないが、「あれば見える」に足る十分な感度が得られているという保障はなく、システムの感度をどのように担保するか検討中である。
ずり応力モデル検証のためには、胚の付近に蛍光マイクロビーズを置き、これで可視化したノード内水流の速度分布を調べている。撮影は昨年度にはできるようになったが、細かい分布を見るにはビーズ径が大きすぎたこと、ビーズを局所的に加えてこれがノードに載ってくれないと観察できないなど、いくつか問題があったため、胚周りの装置や手技を改良してより安定に流れを可視化できるようにした。現在、共同研究でこの解析を進めている。
第三のモデルとして、水流が微小な電位差を引き起こし（流動電位）左右性決定に関わる可能性を検討している。この可能性を検証するため、微小な直流電位を測定できる振動プローブ法と呼ばれる方法を立ち上げつつある。また胚を培養しながら直流電圧をノード付近に印加するシステムも試作中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
「現在までの進捗状況」で述べた撮影条件と定量方法を最適化して、NVPモデルとずり応力モデルの妥当性について結論を出す。これとは別に、流動電位が左右性確立に働いている可能性を検証するため、ノードの水流が引き起こす流動電位の測定、培養胚への強制的な電圧印加が胚の左右性を変えうるかどうかについて検証する。
NVPモデルとずり応力モデルにおいては、そのモデルが示す通りの現象を見つければある意味検証としては終わりで、次の段階としてはそれぞれのキーとなる分子を調べて、流れによる刺激、Ca2+シグナル、非対称な遺伝子発現というカスケードの解明に注力する。
流動電位モデルについては、現在行っている実験が目論見通りの結果を得たとしても、これが生理的現象であるということを担保するのが難しい。電気はあらゆることに影響する可能性があるからである。なので、膜電位の直接的な測定、薬剤やチャネルの強制発現によって膜電位を人工的に変える実験などによって、より厳密に妥当性を検証していく。
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| Causes of Carryover |
研究計画の応募時には1年目に本研究費にてカメラを購入する計画だったのが他の予算で措置できたため今年度（2年目）に繰り越したが、その一方で、計画時には想定していなかった振動プローブ法測定システムが必要になった（「現在までの進捗状況」参照）。システムは現在構築中であり、来年度（3年目）に繰り越す予算はこの機材の購入費に充てる。
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