2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of reproductive process by calcium imaging system
| Project/Area Number |
17K07446
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
岩野 恵 大阪大学, 産業科学研究所, 特任助教(常勤) (50160130)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 発光イメージング / カルシウムシグナリング / シロイヌナズナ / ゼニゴケ / オプトジェネティクス / 生殖過程 / 自家不和合性 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
被子植物の生殖は、花粉の柱頭への受粉過程ではじまり、花粉管の胚珠への誘引を経て、受精へと至る。これら一連の過程では、雌蕊と花粉との細胞間コミュニケーションにより適切な花粉が選抜される。研究代表者はこれまでに、この細胞間コミュニケーションに、Ca2+や活性酸素が関与することを示し、他家・自家受粉時に機能する雌蕊側Ca2+輸送体の実体を明らかにしてきた。しかし蛍光イメージング解析では、光毒性のために花粉管誘因や受精の確立が低くなる。本申請の目的は、励起光なしでCa2+シグナルや電気シグナルを高光度・高感度・高分解能で測定できる発光システムや、光刺激により局所的、一過的に細胞の生理機能をON-OFFできるオプトジェネティック解析を用いて、生殖過程におけるCa2+を介した情報伝達系の詳細を明らかにすることである。そのために野生型と自家不和合性シロイヌナズナを用いて、１）発光Ca2+センサーを用いた他家・自家受粉時の乳頭細胞カルシウムストアのCa2+動態解析、２）オプトジェネティックツールを用いた乳頭細胞のCa2+、活性酸素、アクチン、Ca2+輸送体の機能解析、３）多色発光Ca2+センサーを用いた花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、精細胞、助細胞、卵細胞のCa2+動態解析、４）オプトジェネティックツールを用いた花粉管誘因から受精に至る過程でのCa2+、活性酸素、Ca2+輸送体の機能解析を行い、受粉から受精に至る過程におけるCa2+変動のメカニズム、関与するCa2+輸送体分子の実体、活性酸素やアクチンとの関係を明らかにする。また、研究代表者は、ゼニゴケのカルシウムチャネルが成長、生殖器官の形態形成、受精過程に関与することを見出しており、上記の発光イメージング系を利用して、ゼニゴケの生殖過程のイメージングも行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カルシウムイメージングに必要な発光ベースのカルシウムセンサーの開発が順調に進み、低親和性から高親和性までの各種のインディケーターを開発した。これらのセンサーに各種オルガネラ移行シグナルを付与することで、小胞体、ミトコンドリア、核などでそれぞれカルシウムイメージングを行うための最適化したコンストラクトの構築ができた。それらの遺伝子をシロイヌナズナに導入した結果、１）発光Ca2+センサーを用いた他家・自家受粉時の乳頭細胞カルシウムストアのCa2+動態解析、２）多色発光Ca2+センサーを用いた花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、精細胞、助細胞、卵細胞のCa2+動態解析のための発光シロイヌナズナを作製することができた。高発現体を選抜し、ホモラインを選抜したので、順調に解析を進めることができる。シロイヌナズナとは別に、新たにカルシウムチャネルがゼニゴケの生殖器官の形態形成や生殖過程に関与することを示す結果が得られたので、ゼニゴケの生殖器官にも上記のコンストラクトを発現させて、生殖過程におけるカルシウムの関与を明らかにできると期待できる。電気シグナルについては、発光強度が低いため高輝度化を目指す。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本申請の目的は、励起光なしでCa2+シグナルや高光度・高感度・高分解能で測定できる発光システムや、光刺激により局所的、一過的に細胞の生理機能をON-OFFできるオプトジェネティック解析を用いて、生殖過程におけるCa2+を介した情報伝達系の詳細を明らかにすることである。そのためにすでに作製した発光シロイヌナズナを用いて、１）発光Ca2+センサーを用いた他家・自家受粉時の乳頭細胞カルシウムストアのCa2+動態解析、２）多色発光Ca2+センサーを用いた花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、精細胞、助細胞、卵細胞のCa2+動態解析を行う。さらに、オプトジェネティックツールを用いた乳頭細胞のCa2+、活性酸素、アクチン、Ca2+輸送体の機能解析のために、光刺激により活性酸素の産生やCa2+上昇を誘導するSuperNova やPACR などのプローブを上記発光シロイヌナズナに共発現させて、受粉から受精に至る過程におけるCa2+変動と活性酸素やアクチンとの関係を明らかにする。さらに、関与するCa2+輸送体分子の実体を明らかにするために、ノックアウトラインを用いた系についても解析する。また、研究代表者は、ゼニゴケのカルシウムチャネルが成長、生殖器官の形態形成、受精過程に関与することを見出しており、上記の発光イメージング系を利用して、ゼニゴケの生殖過程のイメージング解析も行う。
|
| Causes of Carryover |
（理由）本年度はシロイヌナズナでの発光イメージングのために各種発光プローブの最適化を行い、組織特異的発現のコンストラクトの作製を行った。さらにシロイヌナズナに導入して、ホモラインを選抜し、次年度解析のためのシーズを開発した。イメージング解析はほとんど行なわなかったため、顕微鏡関連の部品類の購入予定額が次年度使用額として生じた。
（使用計画）発光イメージングでは、暗黒下での観察が必要なため、顕微鏡光源由来の光の漏れを完全に遮断する必要がある。本年度は、顕微鏡と光源を分離するため、新たに外付けのLED光源を購入する予定である。
|
