2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of reproductive process by calcium imaging system
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17K07446
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岩野 恵 京都大学, 生命科学研究科, 研究員 (50160130)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 生殖過程 / カルシウムイメージング / シロイヌナズナ / ゼニゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
被子植物の生殖は、花粉の柱頭への受粉過程ではじまり、花粉管の胚珠への誘引を経て、受精へと至る。これら一連の過程では、雌蕊と花粉との細胞間コミュニケーションにより適切な花粉が選抜される。研究代表者はこれまでに、この細胞間コミュニケーションに、Ca2+や活性酸素が関与することを示し、他家・自家受粉時に機能する雌蕊側Ca2+輸送体の実体を明らかにしてきた。一方、陸上植物進化の基部に位置するコケ植物は、配偶体世代が優勢な生活環を有しており、雄株造精器からの精子が造卵器の卵細胞に誘引されて受精が成立することが知られている。このコケ植物での精子誘引から受精に至る過程においてもCa2+を介した情報伝達系の存在が予想されるがその詳細はほとんど知られていない。本申請の目的は、励起光なしでCa2+シグナルを高光度・高感度・高分解能で測定できる発光システムや、オプトジェネティック解析を用いて、生殖過程におけるCa2+を介した情報伝達系の詳細を明らかにすることである。これまでに、被子植物シロイヌナズナを用いて花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、助細胞のCa2+動態を多色発光Ca2+センサーを用いて可視化する系を構築してきた。そこで当該年度は、コケ植物苔類のモデル植物であるゼニゴケを材料として、生殖過程のCa2+動態を可視化する系の構築を目指した。そのために、精子や卵細胞、卵細胞周辺や造卵器頚部の細胞で高発現の遺伝子を探索して、Ca2+センサータンパク質を発現させるためのツールの開発を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
シロイヌナズナでは低親和性から高親和性までの各種のインディケーターに小胞体移行シグナルを付与することで、小胞体、核などでそれぞれカルシウムイメージングを行うための最適化したコンストラクトの構築ができた。それらの遺伝子をシロイヌナズナに導入し、多色発光Ca2+センサーを用いた花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、助細胞のCa2+動態解析のための発光シロイヌナズナを作製し、安定的なホモラインを選抜したので、Ca2+動態解析を進めている。ただ、発光基質の添加のタイミングにより、誘引物質の拡散が生じin vitro受精系を発光イメージング用に最適化する必要がある。
一方で前年度報告したように、ゼニゴケにおいて、カルシウムチャネルの１分子種が生殖器官の形態形成や生殖過程に関与することを示す結果が得られた。本年度その遺伝子のプロモーター解析などを行った結果、卵細胞、卵細胞周辺の組織、造卵器の頚部細胞などで高発現であり、生殖器形成にも深く関与することが示唆されたので、本遺伝子のプロモーター部分をカルシウムセンサータンパク質に繋げることで、ゼニゴケ生殖過程の雌側のCa2+動態を可視化することが可能になり、生殖過程の解明に繋がると期待できる。
9月半ばに大阪大学から京都大学に異動したため、研究環境を立ち上げるのに若干時間を要したが、一方で、ゼニゴケの分子遺伝学的解析が順調に進み本課題推進に大いに役立った。
昨年度作製した光刺激により活性酸素を発生させるオプトジェネティックツールについては、シロイヌナズナでは活性酸素の消去系が発達しており、動物細胞で見られたような細胞死の誘導には至らなかった。そこで、細胞層が少なく、効率的に刺激できるゼニゴケの造卵器などで発現させて、生理的な刺激が可能かどうかについて検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本申請の目的は、励起光なしでCa2+シグナルを高光度・高感度・高分解能で測定できる発光システムや、オプトジェネティック解析を用いて、生殖過程におけるCa2+を介した情報伝達系の詳細を明らかにすることである。これまでに、被子植物シロイヌナズナを用いて花粉管誘因から受精に至る過程での花粉管、助細胞のCa2+動態を多色発光Ca2+センサーを用いて可視化する系を構築してきた。一方で、コケ植物苔類のモデル植物であるゼニゴケを材料として、精子や卵細胞、卵細胞周辺や造卵器頚部の細胞で高発現の遺伝子を探索して、Ca2+センサータンパク質を発現させるためのコンストラクトの開発を行ってきた。そこで本年度は、これらのコンストラクトをゼニゴケに形質転換し、精子や造卵器の細胞質のCa2+動態を可視化する系を作製して、生殖過程におけるCa2+イメージングを行う。シロイヌナズナでは、花粉の誘引に伴って、助細胞でCa2+オシレーションが誘起され、それが花粉管のバーストにつながる。ゼニゴケでも精子が卵細胞に誘引されるためには、卵細胞またはその周辺の細胞から誘引物質が分泌されることが予想され、シロイヌナズナのCa2+動態などと比較解析することで、ゼニゴケの造卵器細胞の性状が明らかになり、精子誘引・生殖過程の解明に繋がることが期待される。さらに、光刺激により活性酸素の産生やCa2+上昇を誘導するSuperNova やPACR などのプローブを上記ゼニゴケ造卵器に共発現させて、精子誘引から受精に至る過程におけるCa2+変動と活性酸素との関係を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度は、新たにゼニゴケでのカルシウムイメージングのために遺伝子の発現解析と、組織特異的発現のコンストラクトの作製を中心に行い、顕微鏡に必要な光源の購入も行ったが、イメージング解析が進まなかった。そのため、論文のデータ解析のためのPCの購入などの予定額が次年度使用額として生じた。
（使用計画）本年度は、データ解析用にPCを購入し、その他、論文投稿費用、成果発表費用に使用する予定である。
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