2017 Fiscal Year Research-status Report
3D ultrastructural analysis of plant endomembrane with high pressure freezing and correlative array tomography
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17K07477
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
豊岡 公徳 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 上級研究員 (10360596)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 高圧凍結技法 / アレイトモグラフィー / 植物細胞 / ３次元超微形態 / 光電子相関顕微鏡 / 細胞内輸送 / 膜交通 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
通常の化学固定で良好な光電子相関顕微鏡(CLEM)解析の結果を得ているERボディGFP及びペルオキシソームGFP発現株、エンドメンブレン系分子のSCAMP2-YFPやSYP41-YFP形質転換体シロイヌナズナの芽生え(発芽7－10日の根、葉)を用いて、高圧凍結固定・凍結置換を行った。アクリル系樹脂包埋のあとに、ダイヤモンドナイフを用いてウルトラミクロトームにより500nmまたは1000nmの準超薄切片を作製し、カバーガラスに貼付け、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光撮影を行った。いくつかのGFP退色防止剤等を含め、最も自家蛍光が少なく、蛍光色素の蛍光強度が強い処理条件を検討した。しかしながら、消失した蛍光はアルカリ処理や退色防止剤で復帰しなかった。そこで、低pHに強い赤色蛍光タンパク質RFPで標識したゴルジ体やエンドソームなどのエンドソーム系も用いて検討を進めるとともに、RFP結合SCAMP2形質転換体作製し、分泌に関与する小胞塊の可視化を進めている。
日立ハイテク社とともに、光顕で撮影した部位と同一箇所をFE-SEMで撮影し、正確かつ容易に画像が重ね合わせることができるCLEM解析システムMirrorCLEMの改良を進め、ソフトウェアの改良や新しい治具を追加し、利便性を向上させた。
切片が厚いほど蛍光強度は強くなるが、FE-SEM像は加速電圧にもよるが厚い切片ではZ軸方向に像が重なってぼやけた像として検出されるため相関が取りにくいことがある。そこで、100-200nmなど可能な限り薄い切片を作製し、高感度の最新の共焦点レーザー顕微鏡により蛍光を検出することで微弱な蛍光を検出でき、かつ自家蛍光を取り除くことができた。
これらの成果はアメリカ顕微鏡学会や日本顕微鏡学会などで発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RFPなど蛍光タンパク質を結合させた細胞内輸送系の形質転換体作製を行えるよう分子生物実験系を立ち上げた。年度の途中に高圧凍結装置が故障し、新しいものに買い換えるトラブルがあったが、概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
新しい高圧凍結装置は今までより３倍凍結面積が大きいため、大きい試料を凍結固定することができる。これらの凍結技術の検討を行うとともに、準超薄切片の蛍光撮影とFE-SEM観察で相関が取りやすい方法を検討する。Z軸方向の相関を取るのが難しいため、共焦点レーザー顕微鏡で広域かつZ方向に撮影するとともに、FE-SEMでも連続切片を撮影するなど工夫する。光電子相関顕微鏡解析ソフトMirrorCLEMの改良をさらに進め、GUIの向上や位置合わせが容易にできるよう改良を進める。
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[Journal Article] Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammation" Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammationx2017
Author(s)
Atarashi K, Suda W, Luo C, Kawaguchi T, Motoo I, Narushima S, Kiguchi Y, Yasuma K, Watanabe E, Tanoue T, Thaiss CA, Sato M, Toyooka K, Said HS, Yamagami H, Rice SA, Gevers D, Johnson RC, Segre JA, Chen K, Kolls JK, Elinav E, Morita H, Xavier RJ, Hattori M, Honda K.
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Journal Title
Science
Volume: 358
Pages: 359-365
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Protonema of the moss Funaria hygrometrica can function as a lead (Pb) adsorbent2017
Author(s)
Itouga M, Hayatsu M, Sato M, Tsuboi Y, Kato Y, Toyooka K, Suzuki S, Nakatsuka S, Kawakami S, Kikuchi J, Sakakibara H
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 12
Pages: e0189726
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The karrikin receptor KAI2 promotes drought resistance in Arabidopsis thaliana2017
Author(s)
Li W, Nguyen KH, Chu HD, Ha CV, Watanabe Y, Osakabe Y, Leyva-Gonzlez MA, Sato M, Toyooka K, Voges L, Tanaka M, Mostofa MG, Seki M, Seo M, Yamaguchi S, Nelson DC, Tian C, Herrera-Estrella L, Tran LP.
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Journal Title
PLOS Genetics
Volume: 13
Pages: e1007076
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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