2019 Fiscal Year Annual Research Report
3D ultrastructural analysis of plant endomembrane with high pressure freezing and correlative array tomography
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17K07477
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
豊岡 公徳 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 上級技師 (10360596)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 高圧凍結技法 / アレイトモグラフィー / 植物細胞 / 3次元超微形態 / 細胞内輸送 / 膜交通 / 電子顕微鏡 / 光電子相関顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エンドメンブレン系分子のSCAMP2-YFPや SYP41-YFP形質転換体シロイヌナズナの芽生え(発芽7-10日の根、葉)を用いて、高圧凍結固定・凍結置換を行った。アクリル系樹脂包埋のあとに、ダイヤモンドナイフを用いてウルトラミクロトームにより500nmまたは1000nmの準超薄切片を作製し、カバーガラスに貼付け、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光撮影を行った。さらに高感度検出器を搭載した共焦点レーザー顕微鏡を用いて、100-200nm超薄切片から蛍光検出を試みた。GFP退色防止剤等を含め、最も自家蛍光が少なく、蛍光色素の蛍光強度が強い処理条件を検討したが良好な結果を得られなかった。他のオルガネラマーカーでは良好な結果が得られたため、タグとして用いている蛍光タンパク質を変える必要性がある結論に至った。赤色蛍光タンパク質RFPで標識したゴルジ体やエンドソームなどのエンドソーム系のコンストラクト作製および形質転換体の作製を進めた。ネイティブプロモーター下で発現するシロイヌナズナ形質転換体を作製し、安定に発現する３世代までの株を得た。この株を用いて、高圧凍結しCLEMするための条件検討を進めた。一方、RFP結合SCAMP2形質転換タバコ培養細胞を用いて、分泌に関与する小胞塊のCLEM解析を進めたが、高圧凍結固定の前に通常の化学固定でCLEMを行なったが蛍光は保存できなかった。これらの成果は米国で開催されたアメリカ顕微鏡学会(M&M)や日本顕微鏡学会などで発表を行った。また、退色防止剤を用いた蛍光復帰によりCLEM法を国際誌MIcroscopyに掲載された。
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