2017 Fiscal Year Research-status Report

鉄腐食性硝酸塩還元菌の系統分類学的多様性および金属腐食発生機構の解析

Research Project

Project/Area Number	17K07546
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	飯野隆夫国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任研究員 (50550323)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2022-03-31
Keywords	微生物腐食 / 金属腐食 / 天然ガス回収施設 / Prolixibacter / 硝酸塩還元菌
Outline of Annual Research Achievements	千葉県山武市の天然ガス回収施設にて、深部605 mに設置されたM-26チュービング (TBG) の内部付着物を収集した。採取した堆積物から微生物の集積培養を行うため、気相を嫌気状態 (N2/CO2 = 4:1) に維持した複数種類の人工海水培地 (Sw培地) に収集試料を投入した。電子受容体にはH2/CO2 (4:1)、チオ硫酸塩、硝酸塩を使用した。炭素源には、酢酸塩、乳酸塩、メタノール、酵母エキス、ペプトンなどを使用した。試料投入後、25℃で2週間培養を行い、培養物を継代した後、再度培養を行った。この作業を2-3回繰り返した。集積培養された生物種を同定するため、集積培養物から染色体DNAを抽出した後、そのDNAを鋳型に16S rRNA 遺伝子をPCRで増幅し、DNAシークエンサーで16S rRNA 遺伝子塩基配列 (500 bp程度) を決定した。その結果、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludisなどに近縁なアーキアやClostridium bifermentans、Desulfotignum balticum、Prolixibacter denitrificansなどに近縁な細菌が集積されていることが明らかとなった。特に、原油備蓄基地由来の原油から分離され、2015年に新規の鉄腐食性硝酸塩還元菌として新規提唱されたP. denitrificansが集積培養されたことは興味深く、天然ガス回収施設にも鉄腐食性硝酸塩還元菌が生息していることが示唆された。そこで、P. denitrificansが属するBacteroidetes門を対象に、集積培養物から細菌の純粋分離を行った。その結果、NT017株、NT023株、NT026株、NT033株、NT049株、NT050株の計6株を純粋分離した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成29年度の目標は、原油備蓄基地や天然ガス回収施設から5-10株の微生物株を純粋分離することを目標とした。サンプリングを行った施設は1施設であったが、収集試料の状態が良好であったことや、採取地と研究室の距離がさほど遠くなく、1日で往復できたことから、迅速に分離作業に移行できた。結果として、6株の微生物株の純粋分離に成功しており、概ね予定どおりの達成度である。
Strategy for Future Research Activity	純粋分離した6株の分子系統位置を明らかにするため、16S rRNA遺伝子塩基配列に基づいた分離株の系統解析を行う。系統解析にはARBを用いて正確な分子系統位置を特定する。系統解析の精度を上げるため、分離株と近縁種の16S rRNA遺伝子塩基配列をARB データベースから抽出し、近隣結合法 (NJ 法)、推定法（ML 法、Bayes 法）、最大節約法（MP 法）を用いて系統解析を行い、分離株の分子系統位置を明らかにする。また、分離株6株に対し、金属鉄 (Fe0) を電子供与体とした金属鉄腐食試験を行い、鉄腐食能の有無を明らかにする。鉄腐食性硝酸塩還元菌の取得が主たる目的であるが、電子受容体には硝酸塩の他、硫酸塩も用いる。また、それぞれに炭素源としての酵母エキス添加と無添加の条件を設定し、合計4種類の培養条件で鉄腐食試験を行う。前培養液を接種して30日間培養した後、試験液中の全溶出鉄量、Fe2+とFe3+の比率をフェナントレン法にて定量し、鉄腐食能を判定する。以上を平成30年度の目標とする。平成31-32年度には鉄腐食細菌の金属鉄腐食発生機構の解析、平成32-33年度には鉄腐食発生メカニズム解明に向けた新規鉄腐食性硝酸塩還元菌の生理・生化学性状の解析を計画している。
Causes of Carryover	理由: 1回目のサンプリングで良好な試料を収集することができ、サンプリング回数を減らすに至った。収集した試料からの微生物の培養も良好であったことから、培養等にかかる費用も最小限に抑えられた。使用計画: 今後実施予定の腐食鉄の構造解析や新規細菌の化学分類分析等は高額である理由から、当初予定では分析回数が制限されていた。そこで、これらの分析の解析検体数を増やし、金属腐食発生メカニズム解明のためのデータの精度向上を図る。