2021 Fiscal Year Research-status Report
鉄腐食性硝酸塩還元菌の系統分類学的多様性および金属腐食発生機構の解析
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17K07546
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
飯野 隆夫 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (50550323)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 微生物腐食 / 鉄腐食 / 天然ガス回収施設 / 鉄酸化 / 硝酸塩還元菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規に純粋分離した鉄腐食原因菌の至適の鉄腐食条件や生理・生化学的特性を明らかにする為、鉄腐食のMariniphaga sp. NT050株と鉄非腐食性のProlixibacter sp. NT017株の形態観察や生理・生化学試験、化学分類試験を行った。NT050株は偏性嫌気性、非運動性、無芽胞、カタラーゼ陰性のグラム陰性桿菌であった。生育可能な温度範囲、pH範囲はそれぞれ25-37℃、pH 6.5-8.0であった。炭素源として唯一D-マルトースを利用することができた。イソプレノイドキノンタイプはMK-7であった。主要の細胞内極性脂質はホスファチジエタノールアミンで、細胞内脂肪酸組成はiso-C15:0とanteiso-C15:0であった。16S rRNA遺伝子に基づく系統解析を行った結果、NT050株はMarinilabiliales目のProlixibacteraceae科に属するMariniphaga sediminis SY21T株に最も近縁で、その相同性は99.9 %と高い値であった。NT050株とM. sediminis SY21T株のキノンタイプ、細胞内極性脂質組成、主要細胞内脂肪酸組成はほぼ同じであった。しかし、表現性状に着目すると、SY21T株は好気条件で良好に増殖するのに対し、NT050株は同条件で増殖不可能であった。SY21株は多くの炭水化物を利用できるのに対して、NT050株はD-マルトースしか利用できず、生化学性状が大きく異なった。以上の分子系統および化学分類性状の観点からは、NT050株はM. sediminisに同定されると考えられたが、表現性状がSY21T株と大きく異なることから、NT050株の正確な分類学的位置を確定する為にM. sediminis SY21T株とのDNA-DNA相同性試験による同定が必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29-30年度にかけて、天然ガス回収施設の貯水槽中に生息する微生物の集積培養および純粋分離を行なった。5-10株を純粋分離すること当初目標とし、最終的に目標を上回る11株を得ることができた。系統的にもBacteroidales目、Clostridiales目、Spirochaetales目、Synergistales目と多様な系統の分離株を取得できた。
令和元年度に、これら11株の金属鉄腐食試験を実施した。その結果、Mariniphaga sp. NT050株が硝酸塩存在下で金属鉄 (Fe0) を腐食することが明らかとなった。Mariniphaga属細菌による微生物腐食は初事例であり、Prolixibacteraceae科としては2属目の事例となった。
令和2-3年度には、鉄腐食性を示したMariniphaga sp. NT050株と鉄腐食性のProlixibacter denitrificansと近縁な鉄非腐食性Prolixibacter sp. NT017株の系統分類学的な特徴づけを行った。Prolixibacter sp. NT017株は通性好気性のグラム陰性桿菌で、増殖には炭素源 (D-グルコースなど) を必須に要求した。NT017株は酸素を電子受容体に利用したが、硝酸塩を利用できず、P. denitrificansと性質が異なった。Mariniphaga sp. NT050株は分子系統および化学分類性状の観点からはMariniphaga sediminisに同定されると考えられた。しかし、NT050株は好気条件で増殖できず、炭素源としてD-マルトースしか利用できないなど、表現性状が基準株であるSY21T株と大きく異なった。以上、研究の進捗は概ね予定どおりの達成度と言えるが、研究を1年延長することで、鉄腐食性の分離株の識別・簡易同定がより明確になると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Prolixibacter属細菌としては2例目となる鉄腐食を引き起こすProlixibacter sp. SD074株を新たに取得した。Prolixibacter 属は鉄腐食性の細菌と鉄非腐食性の細菌を含む分類群である為、両者の識別基準は、鉄腐食原因菌を早期発見する上での重要な情報となる。そこで、Prolixibacter属細菌による鉄腐食発生メカニズム解明に向けて、SD074株の形態情報、生理・生化学性状、化学分類学性状、系統分類学的情報等の解析をを行う。形態学的特徴の解析のため、位相差顕微鏡観察、透過型電子顕微鏡 (TEM) 観察を行い、細胞形態、大きさ、鞭毛や芽胞の有無を観察する。生理・生化学機能解析のために、前培養した供試菌株を各種試験培地に接種し、増殖の可否、基質や代謝産物の増減を分析する。生育温度範囲、生育pH範囲、生育塩濃度範囲、利用できる電子受容体 (硝酸塩、硫酸塩、酸素など)、電子供与体 (Fe0、Fe2+、水素、硫化物など)、炭素源等の性状を明らかにする。増殖の可否は分光光度計による濁度の増加を分析する。基質や代謝産物の増減は、液体クロマトグラフィー (HPLC) やガスクロマトグラフィーを用いて定量分析する。得られた結果を、既知の鉄腐食性細菌P. denitrificans MIC1-1T株、鉄非腐食性のProlixibacter bellariivorans F2T株およびProlixibacter sp. NT017株の知見と比較し、鉄腐食性のSD074株とP. denitrificans MIC1-1T株に特有の特徴を見い出す。
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| Causes of Carryover |
理由: 平成29年度に実施したサンプリングで良好な試料を収集することができ、サンプリング回数を減らすに至った。収集した試料からの微生物の培養も良好であったことから、培養等にかかる費用も最小限に抑えられた。また、コロナ禍に伴う出勤停止により実験が停止した為、研究費の使用に遅れは生じた。
使用計画: 今後実施予定の腐食鉄の構造解析や新規細菌の化学分類分析等は高額である理由から、当初予定では分析回数が制限されていた。そこで、これらの分析の解析検体数を増やし、金属腐食発生メカニズム解明のためのデータの精度向上を図る。
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