2018 Fiscal Year Research-status Report
核に局在するセラミドによるアポトーシス誘導メカニズム
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17K07946
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
藪 健史 日本大学, 生物資源科学部, 研究員 (00551756)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 倫明 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, グループ長 (80344323)
今村 伸太朗 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主任研究員 (80510007)
司馬 肇 (張培淦) 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (90256834)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 水産化学 / セラミド / スフィンゴミエリナーゼ / アポトーシス / ユビキチン / 核 / ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セラミドは，熱や紫外線，化学物質等のストレス，インターフェロンγ，Fasリガンドなどの炎症性サイトカインの刺激に応答して生成され，神経系，血管系，免疫系の形成および性の分化におけるアポトーシスに関与する．申請者らは，アポトーシス誘導時におけるスフィンゴミエリナーゼ群によるセラミド生成機構を明らかにしてきたが，セラミドが核崩壊や遺伝子転写調節を誘発する機序は依然不明である．そこで，本研究では，スフィンゴミエリナーゼを活性化し，膜脂質セラミドを生成し，核崩壊を誘導するスフィンゴミエリナーゼを特定する．この酵素が，核膜を構成するスフィンゴミエリンを加水分解することによって，膜の剛性が微弱となり核膜の崩壊を誘導し，細胞運命を決定することを，バイオアッセイによって解析する．
本年度は，nSMase1のユビキチン化を調べるために，nSMase1やnSMase5を恒常的に発現した細胞株を樹立した．これらの株へHA-タグが付加したユビキチン変異体を発現させて，免疫沈降法とウエスタンブロットの組み合わせによりユビキチン化を調べた結果，すべてのタイプのユビキチン変異体でnSMase1やnSMase5ともにユビキチン化が生じることが明らかとなった，さらに，nSMase1やnSMase5のリジン残基に注目して，nSMase1やnSMase5のリジンをアルギニンへと置換した変異体を作製した．これらのnSMase1やnSMase5変異体を発現させ，ユビキチン化を生じるリジン残基を調べた結果，すべてのnSMase1やnSMase5変異体でユビキチン化が観察された．
これらのことから，nSMase1やnSMase5は，すくなくとも1stメチオニンのアミノ基に直鎖ユビキチン化が生じると推定された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，魚類培養細胞やほ乳類培養細胞でnSMase1およびnSMase5遺伝子を安定的に発現する細胞株の樹立に成功した．nSMase1およびnSMase5の分離・精製手法を確立した．
核に局在するnSMaseは，nSMase1およびnSMase5が推定されるため，nSMase5に対する抗体の作製を試みた結果．nSMase5に対する抗体の作製に成功した．
平成30年度以降の研究計画である「ユビキチン・プロテアソーム系の解析」について，本年度は取り組むことができた．その成果としては，nSMase1やnSMase5を活性化する機構には，1stメチオニンのアミノ基に直鎖ユビキチン化が必須であることが推定されたことである．
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞における核に局在するnSMaseの役割を調べるため，nSMase1遺伝子やnSMase5遺伝子を導入した発現ベクターを作製後，魚類培養細胞あるいはヒト培養細胞へ導入し，nSMase遺伝子を過剰発現させて，アポトーシス誘導能を調べる．ストレスによって応答する分子かどうかをウエスタンブロット解析によって確認するとともに，過剰発現株の核におけるセラミド含量を測定する．セラミド含量の増加と核崩壊とが相関するかを調べる．また，各SMaseの翻訳阻害試験を試みて，セラミド含量の増加とアポトーシスの抑制が相関するかを調べる．
ゼブラフィッシュにおける核に局在するnSMase遺伝子の機能を調べるため，CRISPR/Cas9を用いるゲノム編集技術により本遺伝子を破壊することによって誘発される初期胚の表現型を解析して，遺伝子機能を解明する．CRISPR/Cas9を用いる遺伝子破壊は，ガイドRNAの設計をnSMase遺伝子の翻訳開始点を含む領域に対して約20～30塩基のオリゴヌクレオチドを合成して，受精卵の1細胞期にマイクロインジェクションによりガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを導入し，遺伝子の破壊を試みる.
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| Causes of Carryover |
分担者山下博士と今村博士は，年末に試薬を発注した.その結果，試薬が本年度中に日本に届かなかったため，次年度へと使用額が繰り越しとなった.次年度使用額を用いて試薬代を支払う予定である．
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