2018 Fiscal Year Research-status Report
イメージングMSによる生体内スフィンゴ脂質の組織分布立体的可視化手法の開発
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17K08233
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
三枝 大輔 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 講師 (90545237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
可野 邦行 東北大学, 薬学研究科, 助教 (50636404)
元池 育子 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 准教授 (70347178)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 質量分析計 / イメージングMS / スフィンゴ脂質 / S1P / 立体可視化 / DESI / MALDI / DIUTHAME |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度は、初めに前年度までに確立した川本フィルムによる連続切片作成技術の評価を実施し、マウスあるいはゼブラフィッシュ等の硬組織および軟組織を同時に含む複数種の連続切片の作成に成功した。また、得られた組織切片を高分解能型の質量分析イメージング（MSI）を用いて分析したところ、一部のリゾリン脂質の分布局在を得ることにも成功したことから、川本フィルムによるMSI用組織切片作成技術が、本研究の目的達成に極めて重要であることが明らかになった。現在原著論文として投稿中であり、近日中に学会発表を通じて公開する予定である。
次に、連続切片におけるMSIデータの三次元可視化法の開発にも着手し、現在までに複数枚のMSI画像データをソフトウェアを用いて統合できる可能性を見出している。
さらに、本研究において新たに開発したDESI-DIUTHAMEを組み合わせた手法（浜松ホトニクスとの共同研究・特許出願中）により、m/z 500以下の領域で検出される分子群の検出感度向上に加え、セラミド等のスフィンゴ脂質の検出には成功し、さらにS1Pの検出にも可能性を見出している。今後、本研究課題であるS1Pの機能解析を目的としたMSI検出法の開発に向けて、さらに選択的な抽出溶媒による検出条件を最適化する予定である。
また、平成30年度後半には、川本フィルムを用いることで、9日齢のマウスから全身組織切片の作成に成功している（投稿論文中に記載）。従って、平成31年度は上記全ての手法を用いることで、マウス全身に含まれるスフィンゴ脂質の分布の立体可視化に挑戦する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までに、川本フィルムによる生体組織切片作成法とMSIによるスフィンゴ脂質分布分析法の開発には成功していることから、立体可視化に必要な、安定した組織切片作成技術を開発する目標は概ね達成している。
また、MSIで得られた画像から立体可視化する技術（ソフトウェア）についても、複数枚の連続切片画像を統合することがかのうであり、一定の成果が得られている。
さらに、DESIによる組織切片分析における分子の定量については、内部標準物質の添加あるいは標準溶液を切片上に添加するドロップレット解析により、検量線を作成し、直線性の確認と実測値を回帰することで組織中の濃度を明らかにできることが判明し、MSIによる定量法開発への有用性を見出しているため、概ね順調であると考えている。一方で、本研究の目的分子であるS1Pの検出については、MALDI法からDESI法に切り替えたことにより、一定の強度で検出できる可能性が見出されているが、未だ高感度かつ明瞭な組織分布を得ることができていない。従って、全体的には順調であるが、最も重要なS1Pの高感度検出が遅れていることから、やや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の課題遂行にあたり、モデルマウス解析を実施する上では、S1Pの検出が必須である。従って、平成31年度には、複数種の誘導体化法の検証に加え、開発したDESI-DIUTHAME法による抽出溶媒の条件検討を加える。また、分子をより選択的に検出するためには、高分解能でスペクトルを絞りMS/MSによるフラグメントイオンの検出で分子をイメージングする手法も考案されていることから、S1P分析に応用する予定である。また、S1P検出に最適なDIUTHAMEの作成について、浜松ホトニクスと共同開発することでS1Pの高感度検出を達成する予定である。
また、MSI定量技術開発については、連続切片におけるレーザーマイクロダイセクションで得られた切片をLC-MS/MSで定量する技術と組み合わせ、組織に含まれる濃度の真度を評価する予定である。
最終的には、既に構築した技術である、川本フィルムによる組織切片の作成法、DESI-DIUTHAMEによる分子イメージング法、イメージングMSで得られた画像の立体可視化法を組み合わせ、モデルマウスあるいは比較的容易にモデルの作成が可能なゼブラフィッシュ等を用いたスフィンゴ脂質全身組織分布解析手法の開発と機能解析への応用を実施する。
尚、平成31年度は本研究の最終年度であることから、成果をまとめて論文に投稿する予定である。
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