2017 Fiscal Year Research-status Report

アルツハイマー病の予防・治療の両方に効果を示す化合物の探索

Research Project

Project/Area Number	17K08351
Research Institution	Meiji Pharmaceutical University
Principal Investigator	小山清隆明治薬科大学, 薬学部, 教授 (20225593)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	抗アルツハイマー / アミロイドベータ凝集阻害 / チオフラビン－T法 / 海洋由来真菌
Outline of Annual Research Achievements	我が国では高齢者の増加に伴いアルツハイマー型認知症の患者が増加している。認可された薬剤も対症療法を目的とするもので、根本治療を目指したものではない。そこで、病因の一つと考えられているアミロイドベータタンパク質の凝集に着目（アミロイド仮説ではアミロイドベータのオリゴマーが病因と言われている）し、試験法として一般に用いられているチオフラビン-T法を用いた。この評価法を用いて、海洋由来真菌培養物からアミロイドベータタンパク質凝集抑制化合物を単離し、さらに各種スペクトルデータから構造を解明する事とした。まずはじめに、海洋由来真菌培養物抽出エキス200以上について、チオフラビン-T法を用てアミロイドベータタンパク質凝集抑制を示すエキスを調べた。その結果、MPUC398培養物のクロロフォルム抽出エキスおよび酢酸エチル抽出エキスが阻害活性を示した。この内、酢酸エチル抽出エキスについてチオフラビン-T法で凝集を評価しながら各種クロマトグラフィーを行い化合物の単離を行った。その結果、阻害活性画分Fr. Eから２種の化合物を単離することが出来た。まだ他にも活性を示した画分Fr.Cやクロロフォルム抽出エキスに関してもアミロイドベータタンパク質凝集抑制化合物の存在が考えられるので、凝集抑制化合物の単離を行い、得られた阻害活性化合物に関してはさらに細胞を用いた試験を行う予定である。本研究で得られた化合物がシード化合物となり、今だ開発されていないアルツハイマー型認知症治療薬の開発の一助となりえる事を期待している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 保有する海洋由来真菌培養抽出物の内クロロフォルム抽出エキス94種、酢酸エチル抽出エキス120種についてチオフラビン－T法を用いてアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性を試験したところ、3種の抽出エキス（MPUC398のクロロフォルムおよび酢酸エチル抽出エキス、MPUC385の酢酸エチル抽出エキス）が強い阻害活性を示した。このうち0.05 mg/mLの濃度で約90%の阻害を示したMPUC398の酢酸エチル抽出エキスについて、阻害活性化合物の探索を行った。海洋由来真菌MPUC398を麦（3 kg使用）-人工海水培地を用いて培養を行い、得られた培養物をクロロフォルムおよび酢酸エチルで順次抽出を行い、クロロフォルム抽出エキス13.2 gおよび酢酸エチル抽出エキス8.0 gを得た。得られたMPUC398酢酸エチル抽出エキス8.0 gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画を行い7画分（Fr. A～Fr. G）を得た。得られた7画分について凝集抑制活性試験を行ったところ、Fr. C（2.3 g）とFr. E（0.9 g）に阻害活性が認められた。このうちTLCの結果から分離操作がより容易と思われたFr. EについてさらにODSシリカゲルを用いて分離を行い5画分（Fr. E1～Fr. E5）に分画した。このうちFr. E3とE4に凝集抑制活性が認められた。Fr. E4をさらにHPLCを2度行うことによって化合物1を6.5 mg単離した。またFr. E3はメタノール可溶部と不溶部に分けることが出来不溶部はTLCで単離を確認できたので化合物2とした。
Strategy for Future Research Activity	１．前年度海洋由来真菌MPUC398培養物の酢酸エチル抽出エキスについてアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性試験を評価しながら阻害活性画分Fr. Eから2種の化合物を単離できたので、この化合物の各種スペクトル測定を行い得られたデータから構造を解明する。２．酢酸エチル抽出エキスから得られたもう一つの阻害活性を示した画分Fr. Cについてもアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性試験を評価しながら阻害活性化合物の単離を行う。３．海洋由来真菌MPUC398培養物のクロロフォルム抽出エキスからもアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性化合物の単離を行う。４．得られた化合物についてチオフラビン-T法を用いてアミロイドベータタンパク質の凝集抑制活性試験を行いIC50価を求め、阻害活性の強さを確認する。５．４．で阻害活性が認められた化合物について細胞を評価試験を行う。