2018 Fiscal Year Research-status Report
環境ストレス応答転写因子群の標的遺伝子選択特異性の分子機構解明
| Project/Area Number |
17K08617
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
勝岡 史城 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 准教授 (30447255)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 転写制御 / Nrf2 / Maf |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、環境ストレス応答に関与するCNC群転写因子と小Maf群転写因子（sMaf）のヘテロ二量体の標的遺伝子選択特異性の分子機構を解明することを目的としている。この目的に対して、フレキシブルリンカーペプチドでCNC-sMafの両因子を融合し、強制的に二量体を形成させるテザード分子を作成し、各二量体の機能を特異的に評価する解析系を樹立することを計画した。さらに、CNC群因子のDNA結合が sMaf群因子に依存する点に着目し、テザード分子をsMaf群因子の完全欠失細胞株で評価する計画である。これにより、内因性のCNC因子の干渉を受けずにテザード分子の機能を評価できると考えている。昨年度までに、樹立したsMaf群因子完全欠失細胞株で、Nrf1, Nrf2の機能が完全に欠失していることを確認している。また、テザードNrf1-MafG（T-N1G）およびNrf2-MafG分子（T-N1G）を作成し、レポーター遺伝子解析等おいて両因子が機能的であることを明らかにしている。
今年度は、作成したT-N1GおよびT-N2G分子を、小Maf群因子三重欠失マウスの線維芽細胞に導入し、薬剤セレクションによってT-N1G、T-N2G細胞を樹立した。また、T-N1細胞では、プロテアソーム阻害剤によってT-N1G が誘導されること、T-N2G細胞では親電子性物質によってT-N2Gが誘導されることを確認した。次に、これら細胞を用いてRNAシークエンス解析による網羅的遺伝子発現解析を実施した。その結果、T-N1GおよびT-N2G分子は、一部重複するものの、活性化する標的遺伝子群が異なることが示された。現在、網羅的にゲノム結合領域を明らかにする目的でクロマチン免疫沈降（ChIP）-シークエンス解析の条件検討を実施している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
主要な計画であるテザード分子(T-N1GおよびT-N2G）をsMaf完全欠失マウスに導入したT-N1G細胞、T-N2G細胞を樹立した。また、これら細胞で予想される分子量のテザード分子が発現していることを確認し、また各二量体の標的遺伝子の発現変化をRNAシークエンスによって解析できている。これら解析をメインに進めたため、ヒト培養細胞でのNrf1, Nrf2のChIP-Seqについては、実験条件の至適化等、次年度に実施する予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後、テザード分子発現細胞でのRNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現データ、ChIPシークエンスによるゲノムワイドな結合部位の解析データを統合的に解析し、Nrf1/Nrf2とsMafのヘテロ二量体の標的遺伝子選択特異性の分子機構を解明していく。
|
| Causes of Carryover |
テザード分子を用いた解析で成果があり、RNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析のデータ解析、ChIPシークエンス解析を重点的に進める方針とした。このため、計画の一部、ヒト培養細胞でのNrf1, Nrf2のChIP-Seqについては、実験条件の至適化等を、次年度に実施することとしている。これに関わる試薬等の費用を次年度に繰り越す必要性が生じた。
|
