2019 Fiscal Year Research-status Report
環境ストレス応答転写因子群の標的遺伝子選択特異性の分子機構解明
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17K08617
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
勝岡 史城 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (30447255)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Nrf1 / Nrf2 / 小Maf / 酸化ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、環境ストレス応答に関与するCNC群転写因子と小Maf群転写因子（sMaf）のヘテロ二量体の標的遺伝子選択特異性の分子機構を解明することを目的としている。この目的に対して、フレキシブルリンカーペプチドでCNC-sMafの両因子を融合し、強制的に二量体を形成させるテザード分子を作成し、各二量体の機能を特異的に評価する解析系を樹立することを計画した。さらに、CNC群因子のDNA結合がsMaf群因子に依存する点に着目し、テザード分子をsMaf群因子の完全欠失細胞株で評価する計画である。これにより、内因性のCNC因子の干渉を受けずにテザード分子の機能を評価できると考えている。昨年度までに、テザードNrf1-MafG（T-N1G）およびNrf2-MafG分子（T-N1G）の安定細胞株を樹立し、T-N1GとT-N2G分子は、一部重複するものの、活性化する標的遺伝子群が異なることが示した。
今年度は、樹立した安定細胞株において、T-N1G、T-N2G分子の発現量を厳密に比較検討するため、複数のMafG抗体のウエスタンブロット解析の条件を検討し、市販の抗体の一つが利用可能な事を明らかにした。その結果、現在、T-N1G,T-N2Gを誘導している条件では、T-N1Gの発現量が大過剰であることが明らかとなった。このため、両分子が同程度に発現する条件を再度検討し决定した。この条件で、RNAシークエンス等の解析を行うため、現在試料の調整を行っている。また、T-N1G,T-N2Gの標的遺伝子選択特異性の差異を規定するタンパク質ドメインを明らかにするため、Nrf2のDNA結合ドメインとNrf1の転写活性化ドメインを融合した分子、またはその逆の分子（ドメインスワップ分子）を作成し、機能解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
主要な計画であるテザード分子(T-N1GおよびT-N2G）を発現する安定細胞株を樹立、また、両因子の標的遺伝子選択特異性の差異を規定するタンパク質ドメインを明らかにするためのドメイン解析も順調に進んでいる。また、解析条件の再検討を行い、両因子の発現量を合わせて解析可能な条件を決定することが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、最適化した解析条件にて、テザード分子(T-N1GおよびT-N2G）、及びドメインスワップ分子発現安定細胞株を処理し、RNAサンプル等を準備している。延長した来年度中に、RNAシークエンス等のデータ取得が完了する見込みである。これら結果により、Nrf1-MafG,Nrf2-MafGヘテロ二量体の標的遺伝子選択特異性と、その責任ドメインを明らかに出来ると考えている。
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| Causes of Carryover |
厳密なテザード分子の機能比較を行うため、解析条件の再検討を行った。この条件決定に一定期間要したため、研究期間を1年延長することとなった。新規の解析条件に基づきRNA-Seq等の各種解析を実施し、成果をまとめる予定である。
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