2019 Fiscal Year Research-status Report
脂肪分解酵素を介する内因性ジギタリス物質の産生機序の関与と高血圧発症機序の解明
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17K08997
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
吉賀 正亨 関西医科大学, 医学部, 非常勤講師 (70434834)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
保坂 直樹 関西医科大学, 医学部, 研究員 (30388459)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 内因性ジギタリス様物質 / マリノブファゲニン / マリノブフォトキシン / エステラーゼ / ELISA / HPLC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内因性ジギタリス様物質（EDLF）はナトリウム代謝を介して高血圧発症に関わると考えられている。しかし産生分泌機序が解明されていないため十分な研究が成されていない。EDLFの中でマリノブファゲニン（MBG）とMBGにスベロイルアルギニンがエステル結合したマリノブフォトキシン（MBT）は高血圧発症に強く関係している．しかしMBTとMBGの関係は全く解明されておらず、生体内のどのようなエステラーゼをはじめとするどのような酵素がMBTのエステル結合の分解に関与しているのかまったく解明されていなかった。
今回、標品のMBT（1mg/ml）にトリプシン（1ng/ml、１０μg/ml）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA)（1unit、50unit）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（u-PA）（400unit)、アンジオテンシン変換酵素（ACE)（５ｍUnit)、カリクレイン（1unit）をそれぞれ添加し、37℃で1時間、24時間後にエステル結合の分解により生じたMBGを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて溶出時間ごとに分離しELISAを用いて各分画のMBG様免疫活性物質をenzymelinkedimmunosorbent assay ELISAで測定すればMBGとMBTを両方同時に定量することが可能である。本方法を用いたところ、各酵素で薬理学的な添加量で24時間反応後にはMBGの産生がみられた。
今回はペプチド結合とエステル結合の両方を持つMBTの特殊構造に着目し、トリプシンや凝固線溶系酵素など血中に存在するペプチド結合、エステル結合分解活性発現が想定される数種の酵素検討は非生理的な条件での検討であるが、MBTからMBG変換を確認できた。
酵素の種類や反応条件の更なる検討を要するが、引き続き酵素や反応条件を検討することでいまだ十分解明されていないEDLFの産生メカニズムの解明につながると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本検討方法であるHPLCは1検体測定に時間がかかることと測定後カラムの安定化の時間が必要なため1検体の測定に時間を要する。
基質であるMBTと各種酵素のバランスや反応時間についてのデータがなく、適時調整しながらの進行であるため時間を要している。
またコロナウイルス感染症にともない必要消耗品も入荷が遅れ研究遂行に遅延を生じた
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| Strategy for Future Research Activity |
今まで行ってきた各酵素の薬理学的検討に加え、ホルモン感受性リパーゼの関与の検討について同様の方法を用いて行う予定である。またMBTだけでなく同様に
エステル結合をもつtelocinobufotoxin(TCT)についても同様の検討をおこなう予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度、当初予定より消耗品の使用量が少なかったため、来年度分とあわせて使用し、最終年度であるため、最終年度計画に基づき使用する予定である
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