慢性腎臓病の石灰化冠動脈病変を標的とした新規microRNAsの探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09563
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 赤尾 浩慶 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (50398997)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 石灰化冠動脈病変 / 慢性腎臓病 / microRNAs / エクソソーム / 次世代シーケンサ―

Outline of Annual Research Achievements

慢性腎臓病患者の予後を規定する冠動脈硬化症に対する新たな治療戦略策定を目指し、動脈石灰化の発生と進展の機序解明を目的とする。冠動脈rotablator治療 後に冠循環から体循環に流出する動脈硬化血管壁由来分子を含む血液検体を用い、in vivoのアテローム性動脈硬化に関わるエクソソーム内miRNAを同定し、治療 前後の動態ならびにその機能を解明し、治療法開発への発展を目指す。本年度も高感度が期待できる次世代シーケンサーを用いた解析で、前年度に引き続き慢性腎臓病患者の石灰化冠動脈に対するRotablator治療前後4ポイントで採取した検体の測定を行った。和光純薬Wako exosome Isolation kit PSを用いて血清からエクソソームを抽出し、得られたエクソソームからWako マイクロRNAエキストラクターSPキットを使用してRNAを抽 出した。前年度は得られたサンプルについて、ライブラリ調製をIllumina社SMARTer smRNA-Seq kitで行ったところ、2ポイントで必要量のライブラリが作成できなかった為、新たに3症例の検体を用い現在再検証を行った。追加症例においても、3症例中、2症例でライブラリが作成できず、1症例のみで治療前後でのライブラリが作成できた。この理由として、サンプルのRNA濃度が低いためか、術中のストレスに伴う影響も考慮されている。ライブラリが作成できた1症例をNextSeqによりシーケンスを実施して、得られた読み取り結果をリファレンスゲノムHuman genome hg19を選択してStrand NGS ver3.1ソフトにて解析し治療前後で変化したエクソソーム内miRNAを同定した。今後さらに症例を追加し測定を行い、治療前後で変化したエクソソーム内miRNAを確認する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

追加症例検体を用いてライブラリ作成を行ったところ、必要量のライブラリが作成できないことが多く、引き続き追加症例の収集と測定を予定している為。 研究協力者の助言や実質的な助けを得て、研究計画に基づいた計画と方法で検討を進めている。

Strategy for Future Research Activity

基礎実験で次世代シーケンサーを用いて解析を行なうことにより十分なリードが得られ様々なRNA分子種が検出され、感度、精度共に満足のいく実験条件を設定できたので、今後はこの実験系で追加サンプルとして用意できた慢性腎臓病患者の石灰化冠動脈に対するRotablator治療前後で採取した検体を用いアテローム性動脈硬化に関わるmiRNAを同定し、そのmiRNAの治療前後の動態ならびにその機能を解明することを目指す。また候補miRNAのvalidationをRNAサンプルを用いてreal-time PCRで行い、再現性を確認する予定である。

Causes of Carryover

症例検体を用いてライブラリ作成を行ったところ、必要量のライブラリが作成できず、追加症例として新たに3症例の 検体を用い測定も行ったが1症例のみで測定が可能であった。現在、さらに症例収集を行い測定を予定している為