2017 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of ubiquitin ligase RNF126
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17K10432
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
石田 典子 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 助教 (10361073)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 直 東北大学, 医学系研究科, 助教 (30707013)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ユビキチン / ユビキチンリガーゼ / タンパク分解 / ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ku70/Ku80複合体はDNA二本鎖切断部位に直接結合し、修復複合体のリクルートに機能する非相同末端修復を促進する重要な因子であるが、DNA末端との結合様式より修復完了前にDNAから外れることが重要となる。その役割を担う因子として、研究代表者らはユビキチンリガーゼRNF126がKu80をユビキチン化することにより、DSB修復を促進する重要な役割を果たしていることを発見し報告した。
Ishida N, Nakagawa T, Iemura SI, Yasui A, Shima H, Katoh Y, Nagasawa Y, Natsume T, Igarashi K, Nakayama K. Ubiquitylation of Ku80 by RNF126 Promotes Completion of Nonhomologous End Joining-Mediated DNA Repair. Mol Cell Biol. 2017;37: e00347-16.
RNF126依存性タンパク質分解が果たす役割をマウス個体レベルで解析するために、RNF126ノックアウトマウスを作製し、最初に全身（各臓器）の表現型解析を行った結果、胸腺と生殖器において表現型が観察された。現在、これらの臓器にフォーカスして詳細な解析を進行中である。
また、RNF126ノックアウトマウスから胎仔線維芽細胞を作製し、RNF126欠損細胞を得、これまでにヒト細胞株を用いて得られた表現型がノックアウトマウス初代細胞でも再現できるかを解析中である。
更に、セルトリ細胞特異的RNF126 ノックアウトマウスを作製し、RNF126ノックアウトマウスの精巣における表現型との比較を行っており、RNF126を中心としたKu80ユビキチンリガーゼ遺伝子のヒト・ゲノム多型については探索を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ユビキチンリガーゼRNF126がKu80をユビキチン化することにより、DSB修復を促進する重要な役割を果たしていることを発見・報告できたこと[Ishida N, Nakagawa T, Iemura SI, Yasui A, Shima H, Katoh Y, Nagasawa Y, Natsume T, Igarashi K, Nakayama K. Ubiquitylation of Ku80 by RNF126 Promotes Completion of Nonhomologous End Joining-Mediated DNA Repair. Mol Cell Biol. 2017;37: e00347-16.]、マウス個体レベルにおけるRNF126依存性タンパク質分解が果たす役割を明らかにするために、RNF126のノックアウトマウス・コンディショナルノックアウトマウスを作製し、全身（各臓器）の表現型解析を行った結果、観察された胸腺と生殖器における表現型の詳細な解析が進行中である。以上については予想通り、あるいはそれ以上に進んでいる。
しかし、RNF126を中心としたKu80ユビキチンリガーゼ遺伝子のヒト・ゲノム多型解析については、倫理審査申請の遅れとノックアウトマウス・コンディショナルノックアウトマウスの解析を優先させたことにより、遅延している状況である。
一方で、研究代表者の血液由来細胞よりリンパ芽球細胞（不死化B細胞）を作製し、RNF126タンパク質の発現を確認出来ているため、総合的には研究課題は概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1 RNA126ノックアウトマウス・コンディショナルノックアウトマウスの解析
(1) 胸腺の表現型解析：胸腺T細胞の分化、及び脾臓B細胞の分化（フローサイトメーターを用いた細胞分化解析）。また、分化に異常が見られた場合は、 T細胞のV(J)D組み換え、及びB細胞のクラススイッチ組み換えについて解析する。
(2) 精巣の表現型解析：精細管の病理的解析、死細胞、細胞分裂の確認。分化段階の特定の細胞に死細胞が確認された場合は、マーカータンパク質に対する抗体で検出、胎仔の発達段階における各マーカータンパク質の定量解析を行う。また、セルトリ細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するTgマウス(Amh-Cre)と交配し、セルトリ細胞特異的RNF126 KOマウスを作製して、その表現型解析を行う。
2 RNF126を中心としたKu80ユビキチンリガーゼ遺伝子のヒト・ゲノム多型の探索の続きを行う。
3 ヒト単核球由来株化細胞を用いた表現型解析：(1) CRISPR/Cas9によるレアバリアント変異導入、(2) リアルタイムPCRによるmRNA定量、(3) イムノブロットによるタンパク質（ユビキチンリガーゼ、およびKu70/Ku80）発現量・安定性解析、(4) 表現型解析 (IR照射後のタイムコースにおけるDNA損傷修復能の比較等)について行う。
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| Causes of Carryover |
本研究課題は以下のように遂行している。① RNF126のマウスより作製した胎仔線維芽細胞やマウス個体における機能解析、② RNF126を中心とした、Ku80ユビキチンリガーゼ遺伝子のヒト・ゲノム多型の探索およびゲノム情報提供者の血液由来の株化Bリンパ球細胞の解析。H29年度は研究代表者の所属機関の業務の関係上、②の研究進捗が遅延しており、次年度使用額が生じた。特に①を遂行するために、細胞培養を行い解析するための試薬や抗体、血清、プラスティックウェア等の消耗品を購入する。また、遅延している②を遂行するために、新しく研究・解析用のPCを購入予定である。
また、国内・国際学会に参加・発表するために旅費を使用予定である。
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[Journal Article] The SCFβ-TRCP E3 ubiquitin ligase complex targets Lipin1 for ubiquitination and degradation to promote hepatic lipogenesis.2017
Author(s)
Shimizu K, Fukushima H, Ogura K, Lien EC, Nihira NT, Zhang J, North BJ, Guo A, Nagashima K, Nakagawa T, Hoshikawa S, Watahiki A, Okabe K, Yamada A, Toker A, Asara JM, Fukumoto S, Nakayama KI, Nakayama K, Inuzuka H, Wei W
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Journal Title
Sci Signal
Volume: 10
Pages: eaah4117
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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