2017 Fiscal Year Research-status Report
乳癌の乳管内進展に関する画像評価と分子生物学的切除断端マーカー開発に向けた研究
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17K10565
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
蒔田 益次郎 日本医科大学, 医学部, 教授 (10229338)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
軸薗 智雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 研究員 (10465312)
石川 朋子 お茶の水女子大学, ヒューマンライフイノベーション研究所, 特任准教授 (70212850)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 乳癌 / 部分切除 / 切除線決定 / 造影超音波 / マイクロＲＮＡ / 乳管内視鏡 / 洗浄細胞診 / 穿刺吸引細胞診 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
造影超音波を用いた乳癌部分切除における切除線決定については、症例を重ねた結果、乳管内進展の候補となる小さな低エコー域に注目して造影の有無で判断することで進展の有無をとらえられることが分かった。このことを利用して術前に外来でハイドロゲルフィルム剤を患部に載せて進展部分を下書きし、下書きをもとに水系エマルジョン樹脂塗料を用いて病変の進展範囲と切除範囲を模型化している。この模型化までの過程については確立できたので、「マスキングカラーシミュレーション」として、学会発表して症例を集積中である。
細胞検体からのＲＮＡ抽出については乳癌症例の癌部、非癌部のサンプルを採取している。当初非癌部は切除断端の面を擦過して細胞採取をしていたが、穿刺吸引で採取するほうが効率が良いことがわかり、癌部と非癌部をそれぞれ穿刺吸引する方法とした。さらに対象を乳房切除症例にも拡張した。また、乳管内からの細胞採取として乳管内視鏡検査時の洗浄細胞診検体の一部を利用することとした。洗浄細胞診には乳管内病変の細胞が豊富に含まれ、同時に組織標本が採取されて病理診断されることもあるので細胞検体と良悪性の対応ができる。マイクロＲＮＡサンプルの質についても氷温下での保存が重要であることがわかってきた。RNA抽出にはRNAiso Plus（タカラバイオ）を用いた。RNA の純度（品質）検定として、まずBioSpec-nano (SHIMADZU)を用いて吸光度を測定し、次にQuantiFluor® RNA System（Promega）にてRNA微量定量を行った。RNA濃度を厳密に測定した上でAgilent 2100 BioAnalyzerでRNA Integrity Number (RIN)を算出し、RNAの品質の客観的評価を行った。試行錯誤の結果、RINが7以上の質の良いRNAを抽出することが可能であることを確認した。サンプルは現在60検体を超し、さらに集積を継続する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
正確な切除に対する切除線決定については3Ｄ表示には至っていないが、術前に外来でハイドロゲルフィルム剤を患部に載せて進展部分を下書きし、下書きをもとに水系エマルジョン樹脂塗料を用いて病変の進展範囲と切除範囲を模型化する方法を確立した。
細胞診検体については当初の予定であった断端からの擦過は細胞採取量が少なく、穿刺吸引という方法へ切り替えた。しかし、この変更によりサンプルは部分切除以外の乳癌症例からも採取が可能となった。さらに乳管内視鏡検査時の洗浄細胞診検体も利用できることがわかり、乳癌の乳管内進展細胞を高純度で採取することが可能となった。現段階はサンプル採取で高質なＲＮＡが採取できる方法の検討段階で、検体保存の氷温下管理でうまくいくことからさらに継続していく。高質なサンプルを収集してからマイクロＲＮＡのアレイ解析へとつなげていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
切除線決定については造影超音波時の所見から模型を作成する方法が確立されたので、今後は症例を集積して、断端陰性率などの評価を行う予定である。また切除方法の手順を確立し、その有効性を検討する。とくに術前の検査時に画像で表示されたものを手術時に再現する方法もさらに検討する。
細胞診検体については採取法、保存法がほぼ確立してきたのでさらに検体を収集し、より高質なＲＮＡサンプルが採取できるようにしていく。
質のよいRNAを得ることが可能となった乳癌サンプルを用いて、次世代型アレイ（Affymetrix社 Clariom D）または定量的RT-PCR法に基づくアレイシステムであるTaqMan Human MicroRNA Array（サーモフィッシャー）を用いて、網羅的かつ定量的なマイクロRNA 発現プロファイルの比較解析を行う。候補となるマイクロRNAについては文献的にも検討し、研究者で協議して決定する。
新たに臨床研究を立ち上げて、臨床検体を用いてValidation を行う。候補マイクロRNA の有無と乳管内進展の有無を照合して候補マイクロRNA が切除断端マーカーとなるかを検証する。
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| Causes of Carryover |
日本臨床外科学会に投稿した切除線決定に関する論文の掲載料の請求が年度内にあるものと考えていたため、他の物品の購入を差し控えていた。しかし、掲載料の請求が次年度となったので次年度への繰り越しとなった。
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