The clarification of pathology and the development of brand-new treatment for nonunion in the point of cell-based therapy

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10953
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 三島 初 筑波大学, 医学医療系, 講師 (60361341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 菅谷 久 筑波大学, 医学医療系, 講師 (10752553)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 細胞治療 / 骨再生 / 難治性骨折 / 骨髄由来間葉系幹細胞 / 脂肪由来間葉系幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

研究計画に従い、骨髄血、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の各々について特性評価を行った。
8週齢のラットの上後腸骨棘から骨髄血採取を試みたが、計画書に記載した採血量（2ml）を安定して採取することができなかった。このため、骨髄液採取の方法として、大腿骨骨髄内をPBS1mlで洗浄（flush out）し、両側の大腿骨から計2mlを採取する方法に変更を行った。またこの方法によって得られる、骨髄細胞を含んだ洗浄液を骨髄洗浄液と定義し、当初評価を計画していた骨髄血から骨髄洗浄液に変更して、以後の研究を進めることとした。平成29年度においては、骨髄洗浄液、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の3つについて、細胞数（有核細胞数、CFU-F 数）、細胞分化能（骨分化、軟骨分化、脂肪分化）、増殖能（Doubling Time）、細胞表面抗原解析(CD34, CD31, CD45, 73, 90, 105, 271)、遺伝子解析(Runx2, ALP, Osteocalcin)を行うこととした。平成29年度内に上記の3つに関する細胞特性の解析が終了する計画であったが、骨髄血採取の妥当性の検討に時間を要したため、解析が完了することができなかった。しかし、すでに検体の採取は終了しており、細胞数、分可能、増殖能、細胞表面抗原解析、遺伝子解析を順次進めており、平成30年度に計画している研究については計画通り進めていくことが可能であると見込んでいる。今後実施を計画している内容での課題として、安定して疾患再現可能な動物モデルについてさらなる検討が必要となる可能性がある。他方、文献学的考察として、より成熟した動物個体（12－14週齢）では安定して疾患再現が可能との複数の報告があり、本課題が生じた場合にはより成熟した個体を使用して検討を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

8週齢のラットの上後腸骨棘から骨髄血採取を試みたが、計画書に記載した採血量（2ml）を安定して採取することができなかったため、骨髄液採取の方法を大腿骨骨髄内をPBS1mlで洗浄し両側の大腿骨から計2mlを骨髄洗浄液として採取する方法に変更した。またこの変更により当初評価を計画していた骨髄血を骨髄洗浄液に変更し研究を継続している。
骨髄血採取の妥当性の検討に時間を要したため、平成29年度中に解析の完了を見込んでいた骨髄洗浄液、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の3つにおける細胞数（有核細胞数、CFU-F 数）、細胞分化能（骨分化、軟骨分化、脂肪分化）、増殖能（Doubling Time）、細胞表面抗原解析(CD34, CD31, CD45, 73, 90, 105, 271)、遺伝子解析(Runx2, ALP, Osteocalcin)については、平成29年度末の時点で解析が完了していないが、すでに検体採取を終了しており、解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度中に見込んでいた研究計画を全て完了することはできなかったが、すでに検体採取を終了し各々の細胞解析を進めているところであり、平成30年度に計画している研究については計画通り進めていくことが可能であると見込んでいる。
今後実施を計画している内容での課題として、安定して疾患再現可能な動物モデルについてさらなる検討が必要となる可能性がある。他方、文献学的考察として、より成熟した動物個体（12－14週齢）では安定して疾患再現が可能との複数の報告があり、本課題が生じた場合にはより成熟した個体を使用して検討を進める予定である。

Causes of Carryover

骨髄血採取の妥当性の検討に時間を要したため、平成29年度中に解析の完了を見込んでいた骨髄洗浄液、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の3つにおける細胞数（有核細胞数、CFU-F 数）、細胞分化能（骨分化、軟骨分化、脂肪分化）、増殖能（Doubling Time）、細胞表面抗原解析(CD34, CD31, CD45, 73, 90, 105, 271)、遺伝子解析(Runx2, ALP, Osteocalcin)については、平成29年度末の時点で解析が完了できなかったため、見込みよりも使用額が少なくなった。平成30年度には、現在進めている各々の細胞解析に加え、平成30年度に計画している研究を進めていく予定であり、平成29年度に繰り越した金額は平成30年度に使用する計画である。