ユーイング肉腫特異的融合遺伝子タイプによるマイクロRNA発現制御機構に関する解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10971
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 河野 正典 大分大学, 医学部, 助教 (30571773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田仲 和宏 大分大学, 医学部, 准教授 (10274458)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Ewing肉腫 / EWS-Fli1 / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではEwing肉腫をEWS-Fli1融合遺伝子のsubtypeでの生物学的差異に着目、type specificなEWS-Fli1 knock downによるmiRNAおよびmRNAの発現変化を網羅的に解析し、subtype別にEWS-Fli1がmiRNA発現を制御するメカニズムの解明と臨床応用に展開するための基礎となる研究を行う。
我々は、Ewing肉腫の特異的融合遺伝子産物EWS-Fli1が、その切断点によるタイプの違いによってmicroRNA (miRNA)及び標的mRNA発現にどのような影響を与えているかを解析してきた。切断点の異なるEWS-Fli1 type 1及びtype 2を、各々に特異的なsiRNAによりknock downした後に、有意な発現変化を示すmiRNAとその標的mRNAを網羅的に解析することで、１）Ewing肉腫の性質を普遍的に規定する因子、２）予後不良のtype 2に特有な予後規定因子、３）より選択的な治療標的となる因子、を同定することを目的として研究を行った。本研究ではEwing肉腫をEWS-Fli1融合遺伝子のsubtypeでの生物学的差異に着目、type specificなEWS-Fli1 knock downによるmiRNAおよびmRNAの発現変化を網羅的に解析し、subtype別にEWS-Fli1がmiRNA発現を制御するメカニズムの解明と臨床応用に展開するための基礎となる研究を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度、以下の点について解析を行った。１）　Ewing肉腫細胞の異なるEWS-Fli1 subtype間で共通に発現上昇または低下するmiRNA, mRNAを抽出した。同時にtype間で発現上昇もしくは低下が一致しない遺伝子も抽出させた。具体的にはEWS-Fli1 type1を有する2種類の細胞株においてそれぞれEWS-Fli1 type 1のsiRNAを導入した導入群と非導入群と比較すると69個のmiRNAが上昇し, 21個のmiRNAが低下していた。EWS-Fli1 type 2を有する2種類の細胞株においてそれぞれEWS-Fli1 type 2のsiRNAを導入した導入群と非導入群と比較すると14個のmiRNAが上昇し, 63個のmiRNAが低下していた。２）EWS-Fli1 type1を有する2種類の細胞株においてそれぞれEWS-Fli1 type 1のsiRNAを導入した導入群と非導入群と比較すると297個のmRNAが上昇し, 9個のmRNAが低下していた。EWS-Fli1 type 2を有する2種類の細胞株においてそれぞれEWS-Fli1 type 2のsiRNAを導入した導入群と非導入群と比較すると393個のmRNAが上昇し, 260個のmRNAが低下していた。3）上記1）2）のデータを掛け合わせそれぞれのsiRNAを導入した後、type 1とtype 2に共通して上昇したmiRNAは4個、低下したmiRNAは3個であった。またそれぞれのsiRNAを導入した後、type 1とtype 2に共通して上昇したmRNAは7個、低下したmRNAは0個であった。

Strategy for Future Research Activity

昨年度は網羅的解析により上記【現在までの進捗状況】に記載した 1）～3）から特異的染色体転座によりつよく影響を受けているmiRNA、mRNAを同定が可能な段階まで解析を進めてきた。本研究は、Ewing肉腫におけるEWS-Fli1 break pointの違いがmiRNA発現にどのように影響しているかを究明し、type1, type 2それぞれの予後不良因子およびより選択的な治療標的の同定、バイオマーカーの開発をも視野に含めた研究であり新たな治療方の開発につながる基礎研究へ発展させることが可能となってきた。今年度は２つの転座形式の差によるmicroRNA発現の意義と表現型への影響を評価する。

Causes of Carryover

予備的実験の検証および解析に時間を要した。そのため結果の解釈と行うべき実験に細かな調整が必要であったため予定よりも物品および結果発表の機会が少なかった。今年度に関しては昨年度行ったデータの解釈に基づき統計学的に信憑性が得られる実験の回数を重ね、その結果をまとめる予定である。さらに学会発表も行っていく。