microRNAによる妊娠高血圧症候群の病態解明と遺伝子治療への応用

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11097
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中畑 克俊 関西医科大学, 医学部, 講師 (70332971) ; 中山 力恒 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90568198) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 遺伝子治療

Outline of Annual Research Achievements

本年は、過去の研究で有用と判明したmiRNAが、ターゲットとするタンパク質を同定する事で、妊娠高血圧症候群発症の新しい機序と、その役割を探求した。さらに、妊娠高血圧に対し、miRNAによる遺伝子治療（核酸創薬）の可能性を示唆する結果を得ることを研究目的にした。

過去の臨床研究論文により、妊娠高血圧症候群患者の胎盤及び血中エクソソームで変化したと報告のあったmiRNAのmimic (Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules, Ambion社)と、そのmiRNAに特異的なmiRNA阻害薬（Anti-miRTM miRNA Inhibitor, Ambion社）を、ヒト血管内皮細胞（HUVEC, HMEC-1細胞）に遺伝子導入を行った。

miR Base等の検索サイトを用いて予測されるmiRNAのターゲットとなる（相補配列を有する）タンパク質の発現が変化していることを、培養細胞実験で確認した。遺伝子導入方法は、Nucleofection法（Amaxa, 現有設備。従来のElectroporation法を改良した手法）を用いた。実験結果として、リアルタイムＰＣＲ法でターゲットとなる特定のmRNAが変化している事を確認後、関連タンパク質の発現が miRNA mimicを遺伝子導入することで発現抑制され、miRNA阻害薬を遺伝子導入することで発現が増加することを、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法により確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実際の臨床研究を開始するに至っていないが、次年度に開始する予定である。

Strategy for Future Research Activity

正常及び妊娠高血圧症候群妊産婦を対象に、胎盤、及び血液中エクソソームからsmall RNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いてmiRNA発現の網羅的解析を行う。上記２群間の胎盤、末梢血中エクソソームのmiRNA発現変化の差を、多変量解析を用いて統計処理を行う。群間で、有意差のあるmiRNAの細胞内パスウェイ解析を行う予定にしている。

Causes of Carryover

本研究に用いられる次世代シーケンサー関連試薬、micro RNA 関連試薬を購入予定であるが、以下のように大変高価である。
Ion PGM システム（次世代シーケンサー）関連試薬としてTotal RNA-Seq Kit v2(12反応)　144,000円、Ion RNA-Seq for AB Library Builder System 156,000円、Ion Xpress RNA-Seq BC 01-16 Kit 192,000円、Ion 318 チップ（半導体マイクロチップ）を用いた一回のランニングコスト　90500円
miRNA 関連試薬として、mirVanaTM miRNA Isolation kit 1kit(40回分)/44,000円、mirVana miRNA mimic 58,000円、mirVana miRNA Mimic Negative Control 57,000円、mirVana miRNA Mimic Positive Control 57,000円、その他の、PCR関連品、細胞培養実験に有する費用も大変高価である。

Research Products

• [Journal Article] Dynamic Needle Tip Positioning for Ultrasound-Guided Arterial Catheterization in Infants and Small Children With Deep Arteries: A Randomized Controlled Trial. (2018)
  • Author(s): Takeshita J, Yoshida T, Nakajima Y, Nakayama Y, Nishiyama K, Ito Y, Shimizu Y, Takeuchi M, Shime N.
  • Journal Title: J Cardiothorac Vasc Anesth. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1053/j.jvca.2018.12.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prohemostatic Activity of Factor X in Combination With Activated Factor VII in Dilutional Coagulopathy. (2018)
  • Author(s): Takeshita S, Ogawa S, Nakayama Y, Mukai N, Nakajima Y, Mizobe T, Sawa T, Tanaka KA.
  • Journal Title: Anesth Analg. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1213/ANE.0000000000003858.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Changes in MicroRNA Expression Level of Circulating Platelets Contribute to Platelet Defect After Cardiopulmonary Bypass. (2018)
  • Author(s): Mukai N, Nakayama Y, Ishi S, Ogawa S, Maeda S, Anada N, Murakami S, Mizobe T, Sawa T, Nakajima Y.
  • Journal Title: Crit Care Med. Volume: 46 Pages: e761-e767
  • DOI: 10.1097/CCM.0000000000003197.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Comparative Study of Point-of-Care Prothrombin Time in Cardiopulmonary Bypass Surgery. (2018)
  • Author(s): Okabayashi S, Ogawa S, Tanaka KA, Nishiyama T, Takeshita S, Nakayama Y, Nakajima Y, Sawa T, Mizobe T.
  • Journal Title: J Cardiothorac Vasc Anesth. Volume: 32 Pages: 1609-1614
  • DOI: 10.1053/j.jvca.2017.12.044.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Potential contribution of erythrocyte microRNA to secondary erythrocytosis and thrombocytopenia in congenital heart disease. (2018)
  • Author(s): Mukai N, Nakayama Y, Murakami S, Tanahashi T, Sessler DI, Ishii S, Ogawa S, Tokuhira N, Mizobe T, Sawa T, Nakajima Y.
  • Journal Title: Pediatr Res. Volume: 83 Pages: 866-873
  • DOI: 10.1038/pr.2017.327.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research