小児神経芽腫、腎芽腫におけるエキソソームによるリキッドバイオプシーと治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11524
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 上原 秀一郎 日本大学, 医学部, 准教授 (00448060)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安藤 清宏 昭和大学, 大学共同利用機関等の部局等, 講師 (10455389) ; 川島 弘之 日本大学, 医学部, 助手 (60645703) ; 越永 從道 日本大学, 医学部, 教授 (70205376)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: エキソソーム / リキッドバイオプシー

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き第一段階として、細胞株を用いたエキソソームの回収とキャリアーとしての役割について検討するため、各種腫瘍細胞株をin vitroにて培養した。細胞株は計画を一部変更しヒト腎芽腫細胞株（WT-CLS1）ヒトラブドイド腫瘍細胞株（G401）、ヒト胎生腎由来細胞株（293T） に厳選し実験を遂行した。ExoQuick-TCTM試薬 (System Biosciences社) を使用し、それぞれの腫瘍細胞から分泌されたエキソソームを培養上清から回収した。
次に、細胞株エキソソームからのmiRNAの抽出と次世代シーケンシングを用いたプロファイリングを行うため、第1段階で抽出したそれぞれの細胞株由来のエキソソームから、The Total exosome RNA and protein isolation kit (Invitrogen社)を用いて、RNAを抽出した。抽出したRNAのシーケンシングをDNAチップ研究所社に委託し、現在網羅的発現解析中である。本年度で得られた結果と技術を臨床応用するため、腫瘍モデルマウスを作製し、血液や尿を採取し、形成された腫瘍より流出した特異的miRNAを、血液や尿中のサンプルを用いて、検出可能かを検討していく必要があるが、実験の進行にあわせ一部実験計画を変更し、ヒト腎芽腫細胞株（WT-CLS1）ヒトラブドイド腫瘍細胞株（G401）を用いて腫瘍モデルマウスを作製する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度から引き続き腫瘍細胞から分泌されたエキソソームを培養上清から回収した。回収したエキソソームからRNAを抽出し、網羅的発現解析を外部委託する予定であったが、回収したエキソソームの精製、RNAの抽出に難渋した。最終的には十分に精製され網羅的解析を行うに足る精製度、量のRNAを回収し、網羅的解析を行っているが研究計画よりやや遅れて進行している。

Strategy for Future Research Activity

エキソソームから抽出したRNAを網羅的に解析した細胞株を用いて腫瘍モデルマウスを作製する。マウスの生体内において各種細胞株から形成された腫瘍から流出した特異的miRNAを血液や尿中のサンプルを用いて、検出可能かを検討する。実験の進行具合に合わせ実験計画を一部変更し、ヒト腎芽腫細胞株（WT-CLS1）ヒト腎ラブドイド腫瘍細胞株（G401）を接種し、腫瘍を形成した免疫不全マウスの血液、尿サンプルを採取する。得られたエキソソームを用いて、第２段階で得られた腎芽腫特異的miRNAについての検出を行う。生体内において、腫瘍の大きさに応じて、エキソソームの収量が増大するかも検討する。
腎芽腫患者および腎ラブドイド腫瘍患者からの血液、尿サンプルから昨年度までの研究で得られた各腫瘍に特異的なmiRNAと同じmiRNAが得られれば、以降の実験をそのmiRNAをターゲットとした定量的リアルタイムPCRで定量し、腫瘍特異性、進行度との相関、症例毎の治療前後のペアサンプルを検討する。