2018 Fiscal Year Research-status Report
bFGF誘導性の瘢痕抑制性microRNAの探索と標的核酸治療法開発の基盤研究
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17K11555
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
藤澤 千恵 東邦大学, 医学部, 講師 (10393000)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大西 清 東邦大学, 医学部, 教授 (30194228)
深澤 由里 東邦大学, 医学部, 講師 (90392331)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | miRNA146b-5p / 線維化 / 組織修復 / PDGFRα |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Basic fibroblast growth factor (bFGF)による瘢痕抑制メカニズムにmicroRNAによる標的分子制御の関与を実証するため、2018年度までにArray解析から探索したbFGF誘導性microRNA 146b-5p(miR146b-5p)の標的遺伝子の同定と機能解析を行ってきた。その結果、miR146b-5pはPlatelet-derived growth factor receptorα (PDGFRα)を標的とし、PDGFRαの発現制御から瘢痕線維化を抑制することが推定された。2018年度はmiR146b-5pによるPDGFRαの標的化をさらに実証するためluciferase reporter assayを実施した。また、miRNAと標的分子の可視化解析からPDGFRαとmiR146b-5pの共発現のないことを確認し、miR146b-5pによるPDGFRαの標的化を細胞レベルで証明した。さらにPDGFRαを発現する
Mesenchymal stem cell (MSC)に対するmiR146b-5pの影響を検討した。創傷部でのPDGFRα+/Sca-1+細胞の発現性を検討した結果、bFGF投与創部ではPDGFRα+/Sca-1+細胞が有意に減少し、逆にmiR146b-5p+/Sca-1+細胞は増加していた。これらの相反する増減から、miR146b-5pはPDGFRα+/Sca-1+細胞に発現するPDGFRαを標的とし、その標的化による発現抑制からMSCの増殖を制御し、線維芽細胞抑制から線維化抑制に寄与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PDGFRαがmiR146b-5pの標的分子であることをin vitroで実証するため、PDGFRα 3'UTRにおけるmiR146b-5pの結合部位を選定し、luciferase reporter assayを行なった。RNA22 target prediction programで選定されたnucleotides 4822-4846はluciferase reporter activityにおいて有意な減少が認められた。遺伝子変異導入した結合部位の特異性を確認し、PDGFRαがmiR-146b-5pの標的分子であることをin vitroで証明した。miR146b-5p と標的分子であるPDGFRαの発現を可視化するため、In situ hybridization法と免疫染色の二重染色を行った。その結果、創部の線維芽細胞には両分子の共発現が全くないことからPDGFRαがmiR146b-5pの標的分子であることを強く示唆された。
PDGFRα発現するMesenchymal stem cells (MSCs)が含まれるPDGFRα+/Sca-1+細胞に対するmiR146b-5pの影響を組織レベルで検討した。ラット創部へbFGFを投与後、2, 7,14日目にPDGFRα+/Sca-1+細胞の有意な減少が認められた。これに対してmiR146b-5p+/Sca-1+細胞はbFGF投与後2, 7,14日目で増加していた。bFGFシグナルを抑制するFGFR1siRNAを投与した創部ではPDGFRα+/Sca-1+細胞の増加とmiR146b-5p+/Sca-1+細胞の減少が確認された。
以上からmiR146b-5pはPDGFRα+/Sca-1+細胞のPDGFRαを標的にし、その発現抑制からMSCsの増殖を抑制し線維芽細胞を抑制することで、線維化抑制に働いていることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
miR146b-5pKOラットを作成し、以下について検討を行う。
1. 皮膚創傷部位における瘢痕化形成への影響評価
現在までに検討を行ってきた成果を臓器レベルで実証するため、miR146b-5pKOラットを作成しmiR146b-5p欠失による逆の効果としての瘢痕促進効果を皮膚潰瘍瘢痕形成実験で検証する。方法としてはラット背部に皮膚全層性創傷を作成する。創傷後、瘢痕量の形態計測や瘢痕の質的変化の評価としてPDGFRα、collagen I、IIIおよびMMPなどについて発現量を比較検討することでmiR146b-5pの創傷治癒及び瘢痕形成への影響を評価する。
2. 生体の臓器レベルでの影響評価
miR146b-5pをKOすることにより瘢痕線維化が促進する可能性のある皮膚、肺と腎臓を中心にに関して瘢痕線維化の質的量的な評価を行う。miR145b-5p KOラットについて様々な週齢においてサンプリングを行い、KOすることによる各臓器の形態学的な変化、PDGFRα、FGF、collagen I、IIIおよびMMPなどについて比較検討を行う。
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| Causes of Carryover |
Sprague-Dawleyラットとin vitroで実験を行う予定であったが、miR146b-5pKOラットを作成したことにより新しく個体・臓器レベルでの解析検討に必要なプライマー、抗体などの経費を次年度への使用額とした。
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