2018 Fiscal Year Research-status Report
単一細胞解析による骨芽細胞の運命制御機構の解明と新規骨形成促進剤の標的分子探索
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17K11613
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
吉岡 広陽 国際医療福祉大学, 医学部, 講師 (50523411)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉子 裕二 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 教授 (20263709)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨芽細胞 / 骨代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨芽細胞は骨形成を終えると，大半はアポトーシスにより死滅するが，一部は骨細胞へと分化するほか，骨表面にとどまり休止期骨芽細胞へと分化する。また，加齢による骨量減少は，骨髄の脂肪化を伴うことが多く，その要因の一つに，骨芽細胞の脂肪細胞への分化転換が示唆されている。このように骨芽細胞は多様な運命を辿るが，その詳細な分子機構は不明な点が多い。本研究では，2.3-kb Col1a1プロモーター制御下で蛍光タンパク質Venusを発現するレポーターマウスの頭蓋冠からVenus陽性細胞を単離し，遺伝子発現をシングルセルRNA-seqにより網羅的に解析した。計285個のVenus陽性細胞について解析が終了し，リード数の少ない細胞を除いた計283細胞の遺伝子発現プロファイルを得た。骨芽細胞マーカーの発現プロファイルから，解析したVenus陽性細胞は全て骨芽細胞と断定された。教師なしクラスタリング解析により，骨芽細胞は大きく2つのクラスターに分類された。1つはCd34, Cxcl12など骨前駆細胞マーカーを高発現するクラスター，もう1つは成熟骨芽細胞マーカーであるIbsp，Spp1，Bglapなどを高発現するクラスターである。また，一部の骨芽細胞はPpargやCebpaなど，脂肪細胞のマスター転写因子を含む脂肪細胞関連遺伝子を発現していることが見出された。そこで，高脂肪食とロジグリタゾン（PPARγアゴニスト）を与えたVenusレポーターマウス（4週齢）の大腿骨について，組織学的検討を行った。結果，骨髄にVenus陽性かつ脂肪細胞マーカーPLIN1陽性の細胞が散見され，in vivoにおける骨芽細胞の脂肪細胞への分化転換が示された。以上の結果は，骨髄脂肪化による骨量減少の病態解析に貢献するものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
所属の異動により，実験環境が十分に整備されておらず，一部実験系の確立が滞っている。しかし，次年度には，実験環境がほぼ整う予定であり，当初の計画通りに進めることが出来ると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
シングルセルRNA-seqの解析から得られた骨芽細胞の遺伝子発現プロファイルをもとに，今後は複数の機械学習アルゴリズムを駆使し，さらにバイオインフォマティクスを駆使し，骨芽細胞の分化方向性の決定に働く遺伝子ネットワークの解明を目指す。近年，シングルセルの遺伝子発現プロファイルを解析するための機械学習アルゴリズムが活発に開発されている。中でも，MonocleやSCUBAなど，遺伝子発現情報を用いて擬似的な時間軸を作り出し，細胞系譜を予測するアルゴリズムを活用する。骨芽細胞の分化時間軸（分化の流れ）を予測し，分化方向性を制御する分子機構の理解を試みる。分化の鍵となりうる候補分子について，骨組織，特に，成長，加齢，および場合によっては骨疾患に伴う時空間的分布動態を解析し，骨組織における機能を推測する。また，培養骨芽細胞を分化モデルとしたウイルスベクターを用いた過剰発現，siRNAあるいはCRISPR-Cas9を用いた発現抑制を行い，骨芽細胞の分化に与える影響をin vitroにて検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由としては，所属の異動により，実験環境が十分に整備されておらず，一部実験系の確立が滞ったことによる。次年度には，実験環境がほぼ整う予定であり，新たな実験機器の購入に使用する予定である。また，実験動物（マウス），組織学的解析，細胞培養，ベクターなどの購入に使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
