肥満による変形性膝関節症の発症機構の解明とCCN2によるその制御効果の検討

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11641
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 西田 崇 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (30322233)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936) ; 滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650) ; 高江洲 かずみ (河田かずみ) 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10457228)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 軟骨細胞 / Angiotensin II / CCN2 / ロサルタン / 軟骨変性

Outline of Annual Research Achievements

本申請課題は、膝蓋下脂肪体などの局所の脂肪組織によって産生されるAngiotensin II (Ang II)が軟骨細胞にどの様な影響を及ぼすのか、また軟骨細胞のanabolic因子であるCCN family protein 2 (CCN2)がその作用にどの様に関わっているのかを明らかにすることを目的とする。平成30年度は軟骨細胞に対するAng IIの詳細な作用機構とAng II の合成経路であるRenin-Angiotensin System (RAS)におけるCCN2の発現調節機構を解析した。以下に結果を示す。1. ラット軟骨細胞様RCS細胞にAng IIを添加すると、II型コラーゲン及びアグリカンの遺伝子発現レベルは減少し、Ang II受容体type 1(AT1R)及びtype 2(AT2R)の遺伝子発現レベルは逆に上昇した。2. RCS細胞の培養系にAng IIを添加し続けると、グリコサミノグリカンの蓄積量は有意に減少した。3. AT1R阻害薬であるロサルタンで前処理したRCS細胞にAng IIを添加すると、ロサルタン処理していない細胞に比べてCCN2の産生量は増加し、catabolic因子であるMMP9の産生量は逆に減少した。4. 細胞内シグナル伝達経路の解析では、Ang II刺激によって引き起こされたERK1/2のリン酸化の亢進はロサルタンを添加しても影響を受けなかったが、p38のリン酸化の亢進はロサルタン添加によって減弱した。5. 解糖阻害剤のモノヨード酢酸を用いて軟骨細胞を変性させると、AT1R及びAT2Rの遺伝子発現レベルは有意に上昇した。6. CCN2欠損軟骨細胞ではRAS関連分子の遺伝子発現レベルが野生型の軟骨細胞より有意に上昇していた。これらの結果はCCN2がAng IIの産生を阻害することで、Ang IIによる軟骨変性を抑制することを示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成30年度はゲノム編集技術を用いて、AT1R遺伝子をノックアウトしたRCS細胞の作製に着手しており、間も無く完成する見通しである。また、in vivoにおける解析は、生後6ヶ月齢及び1年齢のCcn2欠損マウスを用いて行っており、その結果、Ccn2欠損マウスは野生型マウスと比較して膝関節にOA様の変化がより顕著に見られることを確認した。これらの点から、当該年度の研究進捗状況は概ね順調であると判断した。

Strategy for Future Research Activity

2019年度はAT1R遺伝子をノックアウトしたRCS細胞にAng IIを添加し、ロサルタン添加時に得られた表現型が再現できるかどうかを解析する。また、生後6ヶ月齢の野生型マウスには膝関節にOA様の変化が見られないが、Ccn2欠損マウスではOA様の変化が見られることから、これらマウスを用いてAT1R及びAT2Rの関節軟骨組織での局在を解析する。当該年度は本研究課題の最終年度であるため、研究成果をまとめ、論文作成を行う。

Causes of Carryover

平成30年度は、AT1R遺伝子をノックアウトしたRCS細胞の作製に着手し、間も無く完成予定である。しかし、年度内に完成することは困難であり、そのために次年度使用額が生じた。令和元年度では次年度使用額と当該年度に請求する助成金を合わせて、AT1R遺伝子ノックアウトRCS細胞の機能解析及びOA様変化との関連性について解析すると共に本研究課題を通して得られた研究成果を論文にまとめて発表する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Circadian production of melatonin in cartilage modifies rhythmic gene expression. (2019)
  • Author(s): Fu, S., Kuwahara, M., Uchida, Y., Koudo, S., Hayashi, D., Shimomura, Y., Takagaki, A., Nishida, T., Maruyama, Y., Ikegame, M., Hattori, A., Kubota, S., Hattori, T.
  • Journal Title: J. Endocrinol. Volume: JOE-19 Pages: 0022.R2
  • DOI: doi: 10.1530/JOE-19-0022.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Possible reparative effect of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) on injured meniscus. (2019)
  • Author(s): Kamatsuki, Y, Aoyama, E., Furimatsu, T., Miyazawa, S., Maehara, A., Yamanaka, N., Nishida, T., Kubota, S., Ozaki, T., Takigawa, M
  • Journal Title: J. Cell Commun. Signal. Volume: 13 Pages: 193-207
  • DOI: 10.1007/s12079-018-0496-9.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Metabolic regulation of the CCN family genes by glycolysis in chondrocytes. (2018)
  • Author(s): Akashi S, Nishida T, El-Seoudi A, Takigawa M, Iida S, Kubota S.
  • Journal Title: J. Cell Commun. Signal. Volume: 12 Pages: 245-252
  • DOI: doi: 10.1007/s12079-017-0420-8.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Physiological role of urothelial cancer-associated 1 long noncoding RNA in human skeletogenic cell differentiation. (2018)
  • Author(s): Ishikawa T, Nishida T, Ono M, Takarada T, Ha N, Kurihara S, Furumatsu T, Murase Y, Takigawa M, Oohashi T, Kamioka H, Kubota S.
  • Journal Title: J. Cell. Physiol. Volume: 233 Pages: 4825-4840
  • DOI: 10.1002/jcp.26285.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCNファミリー遺伝子のエネルギー代謝による制御。 (2019)
  • Author(s): 明石 翔、西田 崇、El-Seoudi A、滝川正春、飯田征二、久保田聡
  • Organizer: 第32回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 軟骨細胞におけるAngiotensin IIの産生調節とその作用。 (2019)
  • Author(s): 西田 崇、明石 翔、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第32回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] Regenerative repairing effect of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) on meniscus. (2019)
  • Author(s): Kamatsuki, Y., Aoyama, E., Furumatsu, T., Miyazawa, S., Maehara, A., Nishida, T., Kubota, S., Takikgawa, M., Ozaki, T.
  • Organizer: ORS Annual meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fibroblast growth factor 1 (FGF-1) impinges on chondrocyte degradation in OA through matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and connective tissue growth factor (CCN2). (2018)
  • Author(s): El-Seoudi, A., Abd El Kader, T., Nishida, T., Aoyama, E., Eguchi, T., Takigawa, M., Kubota, S.
  • Organizer: ASBMR annual meeting,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒト軟骨細胞分化におけるUCA1長鎖非コードRNAの役割。 (2018)
  • Author(s): 石川崇典、西田 崇、大野充昭、古松毅之、村瀬友里香、大橋俊孝、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第31回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 半月板に対する低出力パルス超音波（LIPUS）の効果。 (2018)
  • Author(s): 釜付祐輔、青山絵理子、古松毅之、前原亜美、山中信康、西田 崇、久保田聡、尾崎敏文、滝川正春
  • Organizer: 第31回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 培養軟骨細胞におけるCCN2及びMMP9の産生に対するアンジオテンシンIIの作用。 (2018)
  • Author(s): 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第31回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN3遺伝子の糖代謝を介した制御。 (2018)
  • Author(s): 明石 翔、西田 崇、El-Seoudi A、滝川正春、飯田征二、久保田聡
  • Organizer: 第31回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] FGF-1 affects the expression of MMP-13 and CCN2 in chondrocytes: possible role in osteoarthritis. (2018)
  • Author(s): El-Seoudi, A., Abd El Kader, T., Nishida T., Aoyama, E., Eguch, T., Takigawa, M., Kubota, S.
  • Organizer: 第31回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] LIPUSが半月板に与える効果。 (2018)
  • Author(s): 釜付祐輔、青山絵理子、古松毅之、前原亜美、山中信康、西田 崇、久保田聡、尾崎敏文、滝川正春
  • Organizer: 第50回日本結合組織学会
• [Presentation] 低出力パルス超音波（LIPUS）が半月板に与える影響。 (2018)
  • Author(s): 釜付祐輔、青山絵理子、古松毅之、前原亜美、山中信康、西田 崇、久保田聡、尾崎敏文、滝川正春
  • Organizer: 第36回日本骨代謝学会
• [Presentation] 軟骨細胞、骨芽細胞分化にUCA1長鎖ノンコーディングRNAが与える影響。 (2018)
  • Author(s): 石川崇典、西田 崇、大野充昭、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第36回日本骨代謝学会
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN3遺伝子の糖代謝を介した制御。 (2018)
  • Author(s): 明石 翔、西田 崇、El-Seoudi A、滝川正春、飯田征二、久保田聡
  • Organizer: 第36回日本骨代謝学会
• [Presentation] 局所性Renin-Angiotensin System を介したAngiotensin IIが軟骨基質産生に与える影響。 (2018)
  • Author(s): 西田 崇、堀 綾花、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第36回日本骨代謝学会
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN3遺伝子の糖代謝を介した制御。 (2018)
  • Author(s): 明石 翔、西田 崇、Abdellatif El-Seoudi、滝川正春、飯田征二、久保田聡
  • Organizer: 第10回日本CCNファミリー研究会
• [Presentation] LIPUSによる半月板修復効果の検討。 (2018)
  • Author(s): 釜付祐輔、青山絵理子、古松毅之、前原亜美、山中信康、西田 崇、久保田聡、 尾﨑敏文、滝川正春
  • Organizer: 第10回日本CCNファミリー研究会
• [Presentation] 軟骨細胞によるCCN2とMMP9産生に対するアンジオテンシンIIの作用。 (2018)
  • Author(s): 西田 崇、堀 彩花、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第10回日本CCNファミリー研究会
• [Presentation] 培養軟骨細胞においてアンジオテンシン II は CCN2 と MMP9 の産生を制御する。 (2018)
  • Author(s): 西田 崇、堀 彩花、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会
• [Presentation] 低出力性パルス超音波(LIPUS)による脂肪細胞分化抑制機構の解明。 (2018)
  • Author(s): 長尾有里香、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会
• [Presentation] CCN2 と Rab14 の相互作用が骨・軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割 ～軟骨分化促進因子 CCN2 の新たな細胞内機能～ (2018)
  • Author(s): 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、久保田聡、上岡 寛、滝川 正春
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN3遺伝子の糖代謝を介した制御。 (2018)
  • Author(s): 明石 翔、西田 崇、Abdellatif El-Seoudi、滝川正春、飯田征二、久保田聡
  • Organizer: 第91回日本生化学会
• [Presentation] ヒト科霊長類特異的lncRNAのエレクトロポレーションによる マウス受精卵への効率的なノックインの試み (2018)
  • Author(s): 近藤 星、桑原実穂、Fu Shanqi、池田健司、石川崇典、大野充昭 、西田 崇 、 久保田聡 、服部高子
  • Organizer: ブレインストーミング2018
• [Presentation] Circadian production of melatonin and its receptors in cartilage influences chondrocyte rhythmic gene expression. (2018)
  • Author(s): Shanqi Fu、桑原実穂、内田瑶子、林 大智、下村侑司、高垣安紗美、西田 崇、丸山雄介、池亀美華、服部淳彦、服部高子、久保田聡
  • Organizer: 第91回日本生化学会
• [Presentation] LIPUSが半月板修復に与える影響。 (2018)
  • Author(s): 釜付祐輔、青山絵理子、古松毅之、前原亜美、山中信康、西田 崇、久保田聡、滝川正春、尾崎敏文
  • Organizer: 第33回日本整形外科学会基礎学術集会
• [Presentation] El-Seoudi, A., Abd El Kader, T., Nishida T., Aoyama, E., Eguch, T., Takigawa, M., Kubota, S.: Effect of Fibroblast growth factor 1 (FGF-1) on connective tissue growth factor (CCN2/CTGF) gene expression in chondrocytic cells and its possible role in osteoarthritis. (2018)
  • Author(s): El-Seoudi, A., Abd El Kader, T., Nishida T., Aoyama, E., Eguch, T., Takigawa, M., Kubota, S.
  • Organizer: 第39回岡山歯学会
• [Presentation] 長鎖(約6kb)ssODNおよびCRISPER/Cas9を用いたヒト科霊長類特異的lncRNAのマウス受精卵へのエレクトロポレーションによる高効率ノックインの試み。 (2018)
  • Author(s): 近藤 星、桑原実穂、Shanqi, F., 池田健司、石川崇典、大野充昭、西田 崇、久保田聡、服部高子
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Effect of fibroblast growth factor (FGF-1) on CCN2 gene expression in chondrocytic cells. (2018)
  • Author(s): El-Seoudi, A., Abd El Kader, T., Nishida T., Eguch, T., Aoyama, E., Takigawa, M., Kubota, S.
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Remarks] 岡山大学歯学部口腔生化学
  • URL: www.okayama-u.ac.jp/user/seika/index.html