2019 Fiscal Year Research-status Report

iPS細胞由来間葉系幹細胞を用いた広域顎骨組織欠損再生に向けた基礎的研究

Research Project

Project/Area Number	17K11770
Research Institution	Osaka Dental University
Principal Investigator	橋本典也大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (20228430)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	馬場俊輔大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (40275227) 本田義知大阪歯科大学, 歯学部, 准教授 (90547259)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	iPS細胞
Outline of Annual Research Achievements	申請者らはすでに、口腔軟組織由来iPS細胞の樹立を終え、iPS細胞由来の間葉系前駆(様)細胞(iPSMSLC)への誘導も成功した。本申請では、iPS細胞からiPSMSLCのさらなる樹立効率を高める培養法を見出すとともに、iPSMSLCの安全性をゲノム異常と造腫瘍性とを関連させて明らかにする。 iPS細胞の培養、維持には完全フィーダーレス・シングルセル培養を行うため、理化学研究所からFeeder free培養iPS細胞の譲渡を受けた。DEF-CSD500培養液でフィーダーレス・シングルセル培養が可能であることを明らかにした。また、継代培養を重ねても、未分化マーカーであるOct4やERBB2γの発現をファックス解析で確認した。現在、ゼノフリーでのiPSMSLCの分化条件を検討している状態である。また、移植細胞の生存を改善する方策として新規細胞移植材料であるヒトI型コラーゲン様リコンビナントペプチドCellnestを利用し、間葉系幹細胞の培養を行ったところ融合体の作製が可能となった。さらに、動物への細胞移植を行う。下顎の下縁を覆って皮膚に切開を施す。下顎の中央の空間は下顎骨接合と呼ばれる。このラット顎裂モデルの作製にも成功した。顎裂モデルに作成した骨欠損へ培養骨の移植を行い、骨形成能を評価することが可能となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason フィーダー培養で維持された皮膚由来iPS細胞の完全フィーダーレス・シングルセル培養を試み、様々な培養条件を試したが、成功しなかったので、細胞の変更を行ったため。
Strategy for Future Research Activity	iPS細胞の培養、維持にはフィーダーレス・シングルセル継代を用い、無血清・ゼノフリー環境で行う。多分化能の確認にはFACS、免疫染色、qPCRによる未分化マーカーの発現解析を用いる。iPS細胞培養には、現在のところCellartisr DEF－CSTM500(TAKARA)を使用する予定である。未分化マーカーとしてOct4, Nanog, Sox2, Klf4の遺伝子発現、TRA-1-60の免疫染色、FACS解析を用いる。
Causes of Carryover	国際学会での発表を行わなかったこと。分子生物学的実験回数が少なかったこと。 iPS細胞の培養、維持にはフィーダーレス・シングルセル継代を用い、無血清・ゼノフリー環境で行う。ゼノフリー条件でのiPSMSLCへの分化誘導を確立する。培養骨の骨再生への有用性を検証するため、免疫不全ラットに先天性顎裂モデルを作製する。