2019 Fiscal Year Research-status Report
一次・二次軟骨におけるガレクチン3の機械的刺激負荷応答の相違について
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17K11942
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
寺尾 文恵 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10510018)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 一郎 九州大学, 歯学研究院, 教授 (70241643)
春山 直人 九州大学, 歯学研究院, 准教授 (70359529)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 軟骨分化 / 機械的刺激 / ガレクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、マウス四肢胚由来細胞と下顎頭原基由来細胞を用いて、機械的刺激負荷条件下におけるガレクチン3の発現の変化とその機械的刺激応答のメカニズムを解明することにより、一次・二次軟骨におけるガレクチン3の機械的刺激負荷応答の相違について解析することにより、二次軟骨特異的な軟骨分化制御機構の存在を探求することを目的として研究を行ってきた。
これまで、二次軟骨である下顎頭の原基を摘出し、細胞増殖や機械的刺激下におけるガレクチン3の応答について解析を行ってきた。ガレクチン3のｓｉＲＮＡ導入によるノックダウンは、下顎頭原基由来細胞の増殖を優位に減少させた。また、機械的伸展刺激を付加する実験を行い、ガレクチン3タンパクの発現について、付加15分後にやや上昇傾向がみられ、30分でピークを迎え、60分後には発現が対照群と変わらないレベルにまで低下する結果を得た。このことから、ガレクチン3は機械的刺激に対し、ゆっくり反応することが示唆された。
本年度は、使用していたウシ胎児血清（ＦＢＳ）のロット変更があったため、これまで使用していたＦＢＳと同等の軟骨分化誘導能を有するＦＢＳの選択を行い、機械的刺激に対するガレクチン3の反応を確認した。また、細胞増殖についても、これまでに使用していたＦＢＳと同様に、ガレクチン3のｓｉＲＮＡによるノックダウンにより、48時間後で細胞増殖が優位に減少することを確認した。同様の結果が得られることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究に使用していたウシ胎児血清（FBS）のロット変更があり、実験の再現性を得るために、別のFBSを用いて培養条件の再設定が必要だったため、進捗状況はやや遅れている。同じ10%FBSを含む培地を使用した条件下でも、ロットが変わると軟骨ノジュールの形成期間が変わってしまうため、これまでと同様の結果を得られる培養条件設定に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
新しいFBSを用いて得られた、ガレクチン3のsiRNAの導入後、ガレクチン３発現抑制下における機械的伸展刺激負荷を行ったサンプルの解析をさらに解析し、FAKやAktシグナルの活性化の変化を調べる。同時に、RGDペプチドによりインテグリン阻害条件下での機械的刺激負荷によるシグナルの活性化について検討を行うことにより、インテグリン阻害下における機械的刺激負荷時のガレクチン3の発現、軟骨分化マーカー遺伝子発現や関連するシグナル伝達経路の活性化について、経時的変化を詳細に検討する予定である。
さらに、マウス胎仔四肢胚由来細胞を用いて同様の実験を行い、結果を比較することで、二次軟骨特異的なガレクチン3の機械的刺激応答機構の存在を探る。
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| Causes of Carryover |
本研究に使用していたウシ胎児血清（FBS）のロット変更があり、実験の再現性を得るために、別のFBSを用いて培養条件の再設定が必要だったため。同じ10%FBSを含む培地を使用した条件下でも、ロットが変わると軟骨ノジュールの形成期間が変わってしまうため、これまでと同様の結果を得られる培養条件設定に時間がかかった。
次年度は、令和元年度（平成31年度）に購入する予定であった抗体（JNK/SAPK、PI3K、インテグリン関連）購入に使用する予定である。
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