2018 Fiscal Year Research-status Report
接合上皮発現タンパク質の発現制御による歯周病予防戦略
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17K11994
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 洋平 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (30434088)
高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (30453898)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | アメロチン / FDC-SP / ODAM / 接合上皮 / 炎症 / 歯周病 / 歯肉上皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Follicular dendritic cell-secreted protein(FDC-SP)は、濾胞樹状細胞で発現する低分子の分泌タンパク質であるが、歯周組織では歯根膜および接合上皮で発現する。上皮細胞でのFDC-SPの遺伝子発現に対する炎症性サイトカインの影響を解析した。
Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞をTNF-αで刺激すると、FDC-SP mRNA量は12時間後に最大になり、24時間後に減少した。TNF-α刺激3および6時間後にFDC-SPタンパク質量の増加を認めたが、12時間以降に減少した。FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116~-948塩基対上流)をCa9-22細胞に導入し、TNF-αで刺激すると、ルシフェラーゼ活性が上昇し、転写開始点から-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入した-345mYY1、-345mC/EBP2および-345mC/EBP3ミューテイションコンストラクトを作成した。-345mYY1では、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制された。TNF-α刺激後のFDC-SPの転写活性の上昇は、protein kinase A (PKA)阻害剤、チロシンリン酸化阻害剤、MEK1/2阻害剤およびphosphoinositide-3-kinase（PI3)キナーゼ阻害剤によって抑制された。
Ca9-22細胞をTNF-αで刺激すると、アメロチン(AMTN)mRNAおよびタンパク質量は刺激6時間以降に増加した。-211、-353および-501AMTN LUCコンストラクトをCa9-22細胞に導入し、TNF-αで12時間刺激すると、LUC活性の上昇が認められ、-353AMTN LUCの C/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が部分的に抑制され、C/EBP1とC/EBP2の両方に変異を導入するとさらに活性の上昇が抑制された。TNF-αおよびIL-1βによる-353AMTN LUC活性の上昇は、PKA阻害剤、チロシンリン酸化阻害剤、MEK1/2およびPI3阻害剤存在下で抑制された。以上の結果から、上皮細胞でのヒトFDC-SPとAMTN遺伝子発現は、TNF-α刺激後に、上記のシグナル伝達経路を介して調整されると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
歯根膜および接合上皮で発現するFDC-SPの遺伝子発現に対するTNF-α炎症性サイトカインの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でFDC-SP mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116~-948塩基対上流)を作成し、Ca9-22細胞に導入してTNF-αで刺激した結果、ルシフェラーゼ活性が上昇し、同プロモーターの-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入したミューテイションコンストラクトを使用したLUCアッセイの結果、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制されたことから、FDC-SP遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと。さらに、接合上皮で発現するヒトアメロチン(AMTN)に対するTNF-αの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でAMTN mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、同プロモーターの-353塩基対上流までの C/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が抑制されたため、AMTN遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと、さらにシグナル伝達経路が判明したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
TNF-α刺激で、FDC-SPおよびAMTNの遺伝子およびタンパク質発現が増加することが明らかになった。ルシフェラーゼアッセイおよびミューテイションルシフェラーゼアッセイの結果から、遺伝子プロモーターのどの部分がTNF-α刺激に応答しているかがほぼ明らかになり、各種リン酸化阻害剤を使用したルシフェラーゼアッセイの結果、細胞内情報伝達系が明らかになった。今後、転写因子応答配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ゲルシフトアッセイを行う。また、抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行う予定である。
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[Journal Article] MiR-200b attenuates IL-6 production through IKKβ and ZEB1 in human gingival fibroblasts.2018
Author(s)
Matsui S, Zhou L, Nakayama Y, Mezawa M, Kato A, Suzuki N, Tanabe N, Nakayama T, Suzuki Y, Kamio N, Takai H, Ogata Y
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Journal Title
Inflamm Res
Volume: 67
Pages: 965-973
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] MicroRNA expression in inflamed gingival tissues and effects of miR-200b on the expression of Interleukin-6 in human gingival fibroblasts.2018
Author(s)
Ogata Y, Nakayama Y, Kato A, Mezawa M, Suzuki N, Tanabe N, Nakayama T, Suzuki Y, Kamio N, Takai H, Matsui S
Organizer
EuroPerio9
Int'l Joint Research
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