LAMP-2のアセンブリ制御を利用した塗布式口腔ケアによる癌治療患者のQOL改善

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K12005
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 横山 三紀 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (70191533)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: LAMP-1 / LAMP-2 / リソソーム / オートファゴソーム / アセンブリ / 部位特異的光架橋反応

Outline of Annual Research Achievements

がん治療に用いられる抗がん剤は口腔内の感染症リスクを増加させる。感染症にともなう口腔組織の障害は「食べる能力」を低下させ、全身への感染の引き金となる。したがってがん治療時の口腔組織の生体防御機能の維持は治療の成否を決める重要な問題である。生体防御の最終段階では、加水分解酵素を含むリソソームとファゴソームやオートファゴソームとの融合が中心的な役割を果たす。Lysosome-associated membrane proteins 1/2 (LAMP-1, LAMP-2)はリソソーム膜の主要な膜タンパク質である。
LAMP-1, LAMP-2の単量体の構造は酷似しているにもかかわらず機能的には大きく異なり、LAMP-1欠損マウスは顕著な表現型を示さないのに対して、LAMP-2欠損マウスではリソソームとファゴソームの融合が低下することが示唆されている。本研究に先立ち、LAMP-1, LAMP-2では複合体の形成様式に差があることを報告しており、この知見を糸口として、本研究では両者の複合体の構造を明らかにすることによりLAMP-2がリソソームとファゴソームの融合にどのように関与するかを明らかにしたいと考えた。そしてリソソームの融合を亢進する低分子化合物を探し口腔ケアの開発に貢献する創薬の基盤となる知見を得ることをめざす。
今年度は部位特異的な架橋反応を利用してLAMP-1複合体、LAMP-2複合体の複合体形成に関与する接触面の解析をおこなった。その知見にもとづき、複合体形成に影響を生じる変異の部位を探索した。また変異体が得られた場合の機能解析のためにCRISPR-Cas9システムを用いたLAMP-2欠損細胞の作成に着手した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

LAMP-1, LAMP-2はどちらもタンパク質の大部分はリソソームの内側に向いており、二つの相同なドメイン(N末側-ドメインとC末側-ドメイン)がリンカーで連結された部分、膜貫通領域、短い細胞質側領域から形成される。LAMP-1複合体の形成にはN末側-ドメインが重要であるが、LAMP-2複合体の形成にはC末側-ドメインが重要であることをすでに報告している。結晶構造解析の結果から、各ドメインは相同なβ-プリズム構造をしていることが予想される。そこでLAMP-1の N末側-ドメインと、LAMP-2の C末側-ドメインのそれぞれ対応する分子表面の部位に光反応性アミノ酸を導入し、光照射依存的な架橋の形成の有無を調べた。その結果、両者では異なる部位で架橋が起こることを見出した。さらにLAMP-1の C末側-ドメインと、LAMP-2の N末側-ドメインについても解析を進めて、両者の接触面を同定する予定である。
複合体形成能の異常のある変異体を作成するために、架橋部位の近傍のアミノ酸の変異をおこなった。この解析の過程で、架橋の相手側の部位を同定する新たな方法論を開発することの必要性を認識した。
CRISPR-Cas9システムを用いたLAMP-2欠損細胞の作成に着手し、LAMP-2欠損株を得ることに成功した。

Strategy for Future Research Activity

架橋の相手側の部位を同定する新たな方法論の開発をおこなう。またLAMP-1, LAMP-2のリソソーム内腔側部分(N-ドメインとC-ドメインが連結されたもの)のネガティブ染色をおこない電子顕微鏡観察によりドメイン相互の位置関係の解析をおこなう。
LAMP-2欠損細胞に、野生型LAMP-2あるいはさまざまなLAMP-2複合体形成変異体を導入し、リソソームとオートファゴソームとの融合・分解反応に対する影響を解析する。共焦点顕微鏡、電子顕微鏡による観察をおこなう。野生型LAMP-2、LAMP-2複合体に対して、免疫沈降と質量分析法を組み合わせて、相互作用する因子の比較をおこなう。
またLAMP-2の複合体形成に関与する部位に結合する低分子化合物のスクリーニングをおこない、リソソームとオートファゴソームとの融合・分解反応に対する影響を解析する。

Causes of Carryover

本研究の遂行にあたり、新たな方法論を開発する必要が生じたので、そのために次年度に人件費が必要になるため。