2018 Fiscal Year Research-status Report
オルガノイドを用いたがん関連遺伝子が引き起こすがんエピゲノム変化の解明
Project/Area Number |
17K15003
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Research Institution | National Cancer Center Japan |
Principal Investigator |
成瀬 美衣 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (80549923)
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Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | オルガノイド / エピゲノム / 発がん / メチル化 |
Outline of Annual Research Achievements |
次世代細胞培養法の一つであるオルガノイド培養は、生体内の臓器・組織を反映したモデル系として注目されている。本研究課題では、正常組織よりオルガノ イドを作製し、ゲノム編集を用いた遺伝子改変技術により多段階発がん機構を培養下で再現し、エピゲノム変化の経時的な比較を行なう。これにより、従来の細 胞培養系では困難であった発がん過程でのゲノムインプリンティングを始めとしたエピゲノム変化を培養下で再現し、さらに個体の解析では影響を及ぼす遺伝子 変化以外の環境要因(個体の栄養条件、がん細胞の周辺細胞との関係)を除去することで、多段階発がん過程におけるエピゲノム変化を詳細に明らかにすること を目的とする。そこで、本年度は発がん過程でのメチル化を詳細に調べるためのモデル系の確率として、父方、母方由来のゲノムを分けてメチル化を追跡するため、C57BL/6 x JF1のF1 マウスより正常大腸オルガノイドを樹立した。樹立したオルガノイドの大腸のモデルとしての有用性を示すため、継代毎にDNA抽出を行い、バイサルファイトシーケンスを行うことにより代表的なインプリンティング遺伝子のDMRについて元組織との比較を行った。その結果、Peg10をはじめとしたインプリンティング遺伝子のDMRは体内と同じ状態に培養下で維持できていることを示すことができた。これまで、オルガノイドのアレルを区別してメチル化状態を示した報告は無く、オルガノイドのモデル系としての有用性の指標の1つとして重要な知見を得ることができた。さらにゲノムワイドなメチル化状態を明らかにするため、当初予定としていなかったバイサルファイト全ゲノムシーケンスを行う準備を進めている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は発がん過程でのメチル化を詳細に調べるためのモデル系の確率として、父方、母方由来のゲノムを分けてメチル化を追跡するため、C57BL/6 x JF1のF1 マウスより正常大腸オルガノイドを樹立した。樹立したオルガノイドの大腸のモデルとしての有用性を示すため、継代毎にDNA抽出を行い、バイサルファイトシーケンスを行うことにより代表的なインプリンティング遺伝子のDMRについて元組織との比較を行った。その結果、Peg10をはじめとしたインプリンティング遺伝子のDMRは体内と同じ状態に培養下で維持できていることを示すことができた。これまで、オルガノイドのアレルを区別してメチル化状態を示した報告は無く、オルガノイドのモデル系としての有用性の指標の1つとして重要な知見を得ることができた。 さらにゲノムワイドなメチル化状態を明らかにするため、当初予定としていなかったバイサルファイト全ゲノムシーケンスを行う準備を進めている。 また、上記のオルガノイドに対しゲノム編集によりがん関連遺伝子へ変異の導入を予定の順に進めている。
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Strategy for Future Research Activity |
C57BL/6 x JF1のF1 マウスより樹立した正常大腸オルガノイドに対し、ゲノム編集によりがん関連遺伝子の変異を順に導入を行った。そのオルガノイドの遺伝子導入毎の経時的なメチル化状態の変化を追跡するため、バイサルファイトシーケンスを行う。当初DMR40箇所および、Apc, p53, Krasのプロモーター領域のDNAメチル化解析をSangerシーケンスにより行なう予定であったが、バイサルファイト全ゲノムシーケンスを行う予定に変更し、多段階発がん過程におけるエピゲノム のプロファイルを全ゲノムについて行う。これにより、遺伝子の変異が及ぼすゲノムワイドなメチル化の変化、発がん過程のエピジェネティックな変化を詳細に追跡可能となる。 がん化の指標となるメチル化領域を同定し、抗がん剤をオルガノイドに投薬した場合、その指標がどう変化するかについても知見を得、オルガノイドによる抗がん試験のモデルとなり得るか評価も行う。
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Causes of Carryover |
当初サンガーシーケンスにより特定のDMRについてを調べる予定であったが、がんゲノムについての理解を深めるため、バイサルファイト全ゲノムシーケンスを行う予定に変更を行った。その解析費用のため、次年度使用額へ繰越すことにした。
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