もやもや病iPS由来血管内皮細胞でみられるインテグリン発現低下の病態的意義の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16620
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 浜内 祝嗣 北海道大学, 大学病院, 医員 (70794387)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: iPS細胞 / もやもや病 / 血管内皮細胞 / シェアストレス

Outline of Annual Research Achievements

シェアストレス実験を開始するため、灌流培養ユニットの検討を行った。ネッパジーン社の庄野式灌流培養チャンバーのデモ機を用い、ウシ脳血管内皮細胞を灌流下で培養した。15dyn/cm2で灌流し30時間後に観察をしたが、細胞が剥離し死細胞が多数認められた。次いで、日本ジェネティクス社のibidi pumpを検討した。ウシ脳血管内皮細胞を17dyn/cm2の灌流下で24時間培養した。目立った細胞死も認められず、実験に適していると判断し本製品を購入した。iPS細胞は、健常人由来3株、もやもや病患者由来3株を有している。これまで、マウス胎児由来線維芽細胞をフィーダー細胞としてiPS細胞の培養を行っていたが、ロット差の大きい動物由来成分を可能な限り排除するため、ビトロネクチンコーティング培養皿上で、Essential 8 培地を使用し培養する、フィーダーフリー培養へと変更を行った。iPS細胞から内皮細胞への分化誘導は、iPS細胞に24時間BMP4とFGF2で処理を行い、さらに48時間、FGF2とVEGF添加した培地で処理し、最後に72時間FGF2, VEGFとSB431542を添加し培養を行うことで分化誘導を行っている。しかし、最終的なCD31およびCD144陽性率が10%以下と低値を示すことが度々あった。Y-27632が内皮細胞への分化、細胞増殖を促進するとの報告があり、Y-27632を添加し内皮細胞の誘導効率を検証している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

iPS細胞から内皮細胞への分化誘導効率が低下しており、プロトコールの再検討を行っているため。

Strategy for Future Research Activity

内皮細胞分化誘導に関する最新の知見を参考に、プロトコールを再検討し内皮細胞誘導効率を高める。十分な量の内皮細胞を作製し、シェアストレス実験を開始する。