Elucidation of pathogenic significance of reduced integrin expression in vascular endothelial cells derived from moyamoya disease specific induced pluripotent stem cells

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K16620
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 浜内 祝嗣 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (70794387)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: iPS細胞 / もやもや病 / 血管内皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

iPS細胞は、凍結保存しているもやもや病患者由来3株、対照としての健常人由来3株を利用して実験を行った。血管内皮細胞への分化誘導のための我々の従来のプロトコールでは、マウス胎児由来線維芽細胞をフィーダー細胞としてiPS細胞の培養に用いていた。しかし、動物由来細胞はロット差が大きいことより、これに伴う実験誤差を減らす目的で、フィーダーフリー培養（ビトロネクチンコーティング培養皿上で、Essential 8 培地を使用し培養する）へと変更を行った。
iPS細胞から内皮細胞への分化誘導は当初、以下の3段階（①BMP4＋FGF2、②FGF2＋VEGF、③FGF2＋VEGF＋SB431542）で刺激する方法を取った。しかし、血管内皮細胞の分化誘導効率が安定せず、分化誘導プロトコールの検証を行った。 特にY-27632による血管内皮細胞の誘導効率改善効果を検討したが、明らかな効果は認められなかった。
このため文献を検索し、VEGF＋cyclic AMP(cAMP)での刺激が分化誘導に有効であることを知り、改変した3段階（①FGF2、②FGF2＋BMP4、③VEGF＋cAMP）の刺激を用いることにより、分化誘導を行った。この新たなプロトコールでの分化後の細胞を灌流培養装置のibidi pump用のプレパラートに撒き、培養液の灌流下での培養を行った。しかし分化後細胞は、灌流早期に剥離してしまい、条件をいくつか変えて施行しているが、同じ結果が続いており、実験を進行していくことが出来ない状態が続いてる。これは患者由来誘導細胞、健常人由来誘導細胞ともに同様にみられており、現状、両群間で表現形質の差を認めていない。