2018 Fiscal Year Research-status Report
山椒由来アレルギー（脱顆粒）抑制物質の分子・細胞から生体レベルでの作用機序の解明
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17K18025
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
河野 良平 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (70569110)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 抗アレルギー作用 / 花粉症 / 脱顆粒 / 山椒 / 食品 / 天然物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、花粉症などのⅠ型アレルギー疾患の患者数は増加の一途を辿り、社会的な問題となっていることを理由として、これまでに明らかにした山椒由来脱顆粒抑制物質2種が、複雑なアレルギー反応機構に対してどのように作用しているかを分子・細胞レベルおよび生体レベルで解明することを目的としている．Ⅰ型アレルギー治療薬として用いられている脱顆粒抑制薬はマスト細胞からのヒスタミン等の炎症物質の遊離（脱顆粒）を抑制することによって、Ⅰ型アレルギーの諸症状を緩和する．これまでの研究から、山椒由来脱顆粒抑制物質2種はマスト細胞として扱われるラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3のIgE介在性脱顆粒およびIgE非介在性脱顆粒をどちらも抑制することが明らかとなった. そこで本年度は、山椒由来脱顆粒抑制物質2種の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、タンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出し比較した. また、生体レベルでZP1とZP2が抗アレルギー効果を発揮するか調べるために、ZP1とZP2を大量に精製し、Ⅰ型アレルギーモデル反応である受動皮膚アナフィラキシー（PCA）反応を抑制するかマウスを用いて調べた. さらに、Actin-GFPを安定発現させたRBL-2H3を用いたライブセルイメージング法の確立を目指した. 本年度の研究から、ZP1およびZP2は、その作用機序として脱顆粒反応の起点であるLynの活性化を抑制すること、生体レベルでも脱顆粒反応を抑制する可能性があることを明らかにした.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
山椒由来脱顆粒抑制物質2種（ZP1とZP2）の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、脱顆粒反応に関与するタンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出した. IgE介在性脱顆粒のシグナル伝達の起点に位置しているSrc-family kinaseであるLynは、抗原刺激によりリン酸化されるが、ZP1およびZP2によりそのリン酸化が抑制されることが判明した. また、マウスを用いたPCA反応試験では、あらかじめ耳に抗原特異的IgE抗体を皮内投与することで感作しておき、試験サンプルを経口投与したのちに、尾静脈から抗原を投与することによりアレルギー反応を惹起し、サンプル投与群とvehicle投与群間でアレルギー反応の程度の比較を行った. アレルギー反応の程度評価は、抗原とともにエバンスブルー色素（EB）を投与することで、アレルギー反応により抗体投与部にEBが溶出するため、このEBを抽出し吸光度を測定することで比較した. PCA反応試験の結果、ZP1およびZP2の経口投与によりPCA反応が抑制されることが明らかとなった. 本作用機序は、肥満細胞のトルイジンブルー染色から脱顆粒抑制によるものと示唆された. また、Actin-GFPを安定発現させたRBL-2H3のIgE介在性脱顆粒にともなう細胞形態変化を、共焦点レーザー顕微鏡により生細胞のまま観察するための手法を確立した. 以上の進行状況から、当初の計画通りに進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度は、山椒由来脱顆粒抑制作用を有するZP1およびZP2を用いて、Lynの下流に位置するシグナルを解析するする。さらに、Actin-GFP発現RBL-2H3を用いたライブセルイメージングによってリアルタイムに起こる脱顆粒反応とZP1とZP2の抑制効果を視覚的にとらえ、作用機序解明への手がかりとすることを目指す。さらに山椒中に含まれるZP1とZP2の季節推移や、その他の類似成分の脱顆粒抑制効果についても調査を実施する。
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| Causes of Carryover |
試薬の納期が間に合わなかったため差額が生じました。次年度試薬の購入に使用します。
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