2017 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of cyclin D1 gene expression by lncRNA transcribed from its promoter region
| Project/Area Number |
17K18065
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
米田 竜馬 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (00734881)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | RNAメチル化 / TLS/FUS / pncRNA / m6A |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はlong noncoding RNAによるCCND1遺伝子の発現制御メカニズムを解明することである。平成29年度は、研究計画に従い①メチル化したpncRNA-D断片6とTLSとの結合、②pncRNA-Dのm6A修飾を認識するリーダータンパク質の決定、③修飾酵素であるMETTL3とリーダータンパク質のノックダウンによる影響、を検証した。
①については、m6A修飾を受けていると考えられる配列(GGACU)を中心に、20ntの長さのRNAを合成し、m6A修飾を入れたものと入れていないRNAを用意した。それぞれ5’側をbiotin標識しており、強制発現させたTLSとの結合を見た。その結果、m6A修飾単体ではTLSとの結合が強まることを明らかにした。
②については、候補であったYTHDF1, 2, YTHDC1, hnRNP-A2B1の抗体を用いたRNA免疫沈降法によりYTHDC1が主にpncRNA-Dのm6A修飾を認識していることを明らかにした。
③についてはMETTL3と②で同定したYTHDC1を、siRNAを用いてノックダウンした。METTL3のノックダウンではpncRNA-Dの発現量が上がり、さらに安定性が上昇した。YTHDC1のノックダウンはRNAの安定性には関与していなかったが、METTL3のノックダウンとともにTLSとの結合が強まった。
以上より、m6A修飾がpncRNA-Dの安定性とTLSとの結合に関与していることを明らかにしたので、平成30年度はpncRNA-Dが通常の細胞周期にも関与しているか、に着目して研究を進める。また細胞ストレスにより誘導されるpncRNA-D自体の転写調節機構についても研究を進める。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の研究計画に従い、①ではpncRNA-Dのメチル化の有無によるTLSとの結合強度の違いを、②ではpncRNA-Dのm6A修飾を認識するリーダータンパク質がYTHDC1であることを同定した。③についてはMETTL3とYTHDC１のノックダウンによりpncRNA-DとTLSとの結合が強まることを明らかにした。当初計画していた研究項目を達成できたため、(2)の評価とした。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後はsiRNAによりYTHDC1やMETTL3をノックダウンすることで、細胞周期にどのような影響が出るのかを検証する。また、pncRNA-Dによる細胞周期への影響を確認するため、細胞分裂や増殖が促進しているのかを検証する。今までの実験ではHeLa細胞を用いて研究を進めてきたので、今後は肺がんや乳がん由来の細胞株であるA549やMCF7を用いて、同様の実験を行う予定である。
|
