2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K19212
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
田上 俊輔 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, ユニットリーダー (40586939)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | ペプチド / 試験管内進化 / ポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞の動態を自由に操ることは生物学の究極的課題の１つである．そのために，本研究では人為的に細胞内の酵素の機能を変換する因子を開発する．細胞の動態を制御するためには，細胞内でシグナルや情報が集約的に入出力される分子・経路を標的とすべきである．その意味で，転写・複製などの核酸合成系は理想的な標的といえる．転写・複製は細胞内での遺伝子発現調節が集約される反応系で，多くのタンパク質や低分子がDNA/RNAポリメラーゼの機能調節に関わっている．もし，ポリメラーゼに対して高度な機能を持った調節因子を人工的に合成することができれば，細胞工学・医療での応用可能性は大きい．そこで本研究では，ポリメラーゼをヌクレアーゼに変換するペプチドの開発によって，細胞内での核酸合成・分解を制御すること目指す．本研究ではまず標的として扱いやすいT7 RNAポリメラーゼを用いているが，最終的にはテロメラーゼやウィルス由来のポリメラーゼを標的とした活性変換ペプチドの開発を目標としている．
本年度は機能性ペプチドのスクリーニングの手法の確立のために，申請者が前所属で開発したポリメラーゼの試験管内進化法とmRNA display法を組み合わせる実験を行った．さらに，様々な条件検討の結果，ヌクレアーゼ反応依存的にペプチドを選択するスクリーニング系を確立することができた．今後はこのスクリーニング系を用いてポリメラーゼをヌクレアーゼに変換するペプチドの選択を試みる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，機能性ペプチドのスクリーニングの手法の確立のために，ヌクレアーゼ反応依存的にペプチドを選択するスクリーニング系を確立することが出来た．具体的には，申請者がこれまでに開発したポリメラーゼの試験管内進化法（Tagami S et al., Nature Chemistry, 2017）を応用した．このセレクション方法はRNAポリメラーゼ活性を持つリボザイムの試験管内進化実験用に開発したものだが，mRNA display法と組み合わせることで，ポリメラーゼの活性を制御するペプチドのセレクションにも利用可能だと考えられた．mRNA display法はペプチドとそれをコードするmRNAの間に共有結合を形成することによってペプチドのジェノタイプとフェノタイプをリンクさせるペプチド選択法である．本研究ではまず，ペプチドの発現とmRNAとの複合体の形成を通常のmRNA display法と同様に行った． 次にmRNAの逆転写を行ったが，この際に逆転写のプライマーを標的ポリメラーゼによるポリメラーゼ（ヌクレアーゼ）反応用のプライマーとリンクさせておくことで，ペプチドとヌクレアーゼ反応系をリンクさせることに成功した．さらに，実際にヌクレアーゼ反応が起きたときのみペプチドが回収されるスクリーニング系も確立することが出来た．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はこれまでに確立させたヌクレアーゼ反応依存的ペプチドスクリーニング系を用いて，ポリメラーゼ・ヌクレアーゼ活性変換因子を選択する．このために複数のペプチドライブラリーを対象に５ー２０サイクルほどのペプチド選択実験を行う予定である．ポリメラーゼ・ヌクレアーゼ活性変換因子がスクリーニングによって獲得された際にはさらに生化学実験やＸ線結晶構造解析により，獲得されたペプチドの作用機構を明らかにする．
さらにT7 RNAポリメラーゼ以外の標的分子の検討を進める．本研究では，機能性ペプチドのセレクションのために，大量の標的分子（ポリメラーゼ）を用意しなければならない．そのため標的分子は大量調整しやすいものが好ましい．まずは考えられる候補の中から（テロメラーゼやHIV，HBV等の病原ウィルス由来のポリメラーゼ），本研究に適した性質（発現量・安定性）を持つポリメラーゼを選択する．重要な標的ポリメラーゼが不安定で扱いにくい場合には，標的ポリメラーゼ自体の安定な変異体作成を試みる．具体的にはコンセンサスプロテインデザイン法（Porebski BT et al., 2015, Protein Eng Des Sel）による熱安定変異体の取得等を行う．
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| Causes of Carryover |
本年度は機能性ペプチドのスクリーニングの手法の確立のために，申請者が前所属で開発したポリメラーゼの試験管内進化法とmRNA display法を組み合わせる実験を行った．さらに，様々な条件検討の結果，ヌクレアーゼ反応依存的にペプチドを選択するスクリーニング系を確立することができた．これらの条件検討はスモールスケールで行ったためにコストを節約することが出来た．さらに当初想定していたよりもmRNA displayによるペプチドーmRNA複合体の形成効率が良かったため，条件検討における消耗品費を抑えることが出来た．
そこで本年度使用しなかった分の助成金を翌年分と合わせることによって，実際のペプチドスクリーニングにおいてより大きなペプチドライブラリーを利用し，実験の成功確率を高めることにした．ペプチドスクリーニングにおいて用いるライブラリーのサイズは非常に重要であり，今回次年度使用額が生じたことによって今後の研究を非常に精力的に進められることになった．
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