2018 Fiscal Year Research-status Report
Regulatory mechanisms for microenvironment and metastasis of cancers with glycosphigolipids via extracellular vesicles
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17K19616
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
古川 鋼一 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (80211530)
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2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞外顆粒 / エクソソーム / 癌微小環境 / ガングリオシド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.癌関連糖脂質発現細胞からの液性因子とエクソソーム含有糖脂質の分子種の分別的機能の解析：大腸癌細胞株のGM3, GD3分子種に関し、セラミドの水酸化を中心に脂質化学構造の比較検討を行った。先に検討したガングリオシドGD3の分子種解析と同様に、GM3でも長鎖塩基上のC4水酸化、脂肪酸上のC2水酸化を有するセラミドが主要な脂質構造として検出された。大腸癌細胞株由来のエクソソームを調製して同様の解析を行い、類似の化学構造が存在する感触を得ている。
2.大腸癌細胞株DLD-1の脂質修飾細胞を用いて、NK細胞への感受性の比較検討：脂質修飾の結果得られた正常型セラミドを含むGD3発現細胞では、NKによる細胞傷害の低下が観察された。脂質修飾細胞由来のエクソソームで処理前後のNK細胞による細胞傷害活性を比較検討しているところである。
3.癌細胞由来のエクソソームによる遠隔臓器に対する糖脂質/インテグリンの協働作用の解析：エクソソームのマウス体内動態を検討するために、マウスLewis肺癌(高/低転移性亜株) をマウスに接種後、その体内動態と転移病巣の病理的解析を行った。その結果、高転移株、とくに卵巣高転移株で、筋肉や皮膚に著明な転移を認めた。これらの転移巣由来の細胞株を樹立して、分泌する細胞外顆粒の機能を解析した。概して、高転移株由来細胞外顆粒は、細胞増殖、浸潤度を亢進する作用が認められ、逆に低転移株由来細胞外顆粒は高転移性亜株の増殖、浸潤度を抑制した。さらに、エクソソームにおける糖脂質とインテグリンの会合体の同定を、免疫共沈降とイムノブロッテイングにより行った。まず、インテグリンのサブタイプごとのエクソソーム含有量を、GD3陽性・陰性細胞間で比較検討した結果、多くのインテグリンサブタイプが、GD3発現株由来のエクソソームで著明に増量しており、選択的取り込み機構の存在が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初目指した、癌細胞由来の細胞外顆粒の組成、とくにガングリオシドの組成と、癌転移にもっとも関連が深いと考えられるインテグリンの各サブセットの含量について、分泌元の細胞株における発現レベルと対照させた解析が概ね実行できたことが大きい、とくに、メラノーマ、グリオーマ、肺癌など、異なった癌種であるが、癌関連糖脂質GD3の発現の有無の違いで、分泌顆粒中のインテグリンのレベルが大きく異なることが明らかになり、癌細胞の分泌顆粒の生成機構の理解に大きな進歩が得られたと考える。
また、マウス肺癌細胞株Lewis肺癌の高転移性と低転移性亜株を用いて、マウスに接種した場合の体内動態の大きな違いを病理学的に観察したことと、これらの培養細胞株から分泌される細胞外分泌顆粒が、培養細胞に添加して作用させた時に、高転移亜株由来の細胞外顆粒は、細胞増殖能、浸潤能、移動能を亢進させ、逆に低転移性亜株由来の細胞外顆粒は増殖能、浸潤能、移動能を抑制する機能を示したことから、細胞内のシグナル変化の解析に発展せしめた点、順調な進展と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 癌関連糖脂質発現細胞からのエクソソームの構成分子の解析と生物学的機能の解明を目指してきたが、癌細胞由来のエクソソームの含有糖脂質の分子種の分別的機能解析という点では不十分である。とくに、癌微小環境の免疫系細胞、線維芽細胞等の諸細胞に対するエクソソーム中の糖脂質の作用と作用機構解明という点でやり残した点が多々あるので、残った予算、および新規の研究計画の中で継続発展させる。
2. 癌細胞由来のエクソソームにおける糖脂質・インテグリンの複合体による癌微小環境制御と転移誘導機能の解析を目指してきて、複合体形成に関する一定度の知見が得られた。今後、エクソソーム膜上の複合体形成のメカニズムに関して、さらに生化学的および高解像度のイメージング技術によって解析を進めたい。そのためには、残った予算に加えて、新しい予算の獲得が必須であり、そのために努力を続ける。
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| Causes of Carryover |
本研究で当初目指した、癌細胞由来の細胞外顆粒の組成、とくにガングリオシドの組成と、癌転移にもっとも関連が深いと考えられるインテグリンの各サブセットの含量について、分泌元の細胞株における発現レベルと対照させた解析は概ね実行できた。とくに、メラノーマ、グリオーマ、肺癌など、異なった癌種であるが、癌関連糖脂質GD3の発現の有無の違いで、分泌顆粒中のインテグリンのレベルが大きく異なることが明らかになった。しかし、これらの結果をまとめて論文報告を作成中であるが、データのばらつきが目立ち、有意差の検定に一定の困難が生じてきた。また、マウス肺癌細胞株Lewis肺癌の高転移性と低転移性亜株をマウスに接種した場合の体内動態の違いを病理学的に観察したり、これらの培養細胞株から分泌される細胞外分泌顆粒を培養細胞に添加した時の作用を検討して興味深い結果が得られたが、そのデータ処理においても、正確性に不十分な点が見出されている。したがって、主な実験の再現性を確実なものとするためにさらなる実験の追加が必要となり、研究費を延長して使用することとした。９月末までに実験を終えて論文報告をまとめる予定である。
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[Journal Article] Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation.2018
Author(s)
Songhai Tian, Khaja Muneeruddin, Mei Yuk Choi, Liang Tao, Robiul H. Bhuiyan, Yuhsuke Ohmi, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa, Sebastian Boland, Scott A. Shaffer, Rosalyn M. Adams, Min Dong
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Journal Title
PLoS Biol.
Volume: 16
Pages: e2006951
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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