2017 Fiscal Year Research-status Report
Cell Therapy on Chronic Kidney Diseases by Inducible Podocytes from Somatic Cells
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17K19643
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
横手 幸太郎 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (20312944)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前澤 善朗 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (80436443)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | 転写因子 / ポドサイト / 分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CKDはeGFRの低下または尿蛋白を呈し、徐々に腎障害の進展をきたす疾患である。その病態の一部として、腎糸球体ポドサイトが尿中へ脱落あるいはアポトーシスを起こすことが重要な役割を果たしている。今回我々は将来の細胞治療の為に線維芽細胞にポドサイト特異滴な転写因子セットを遺伝子導入することで、ダイレクトリプログラミングによりin vitroにてポドサイトを作成することを目的とした。まず、公共のデータベースならびに過去の文献検索から、ポドサイトに特異的に発現しその分化に関連すると考えられる転写因子としてWt1, Lmxb1, Foxc2, Mafb, Tcf21, Foxd1, Hoxc1, Eya4, Arnt2, Foxd2, Pbx2, Hoxc5, Scx, Sall1, Sox5をピックアップしcDNAクローニングを行なっている。また、マウス胎児Fibroblast (Mef)を採取し３株を樹立した。さらに、Podocin-rtTa, TetOCre, ならびにmTmGマウスを交配しtriple transgenic マウスを作成、Dox誘導を行い腎臓を観察したところ、ポドサイト特異的にGFPの発現を認め、このマウス由来のMefに転写因子の導入を行い、ポドサイト分化のスクリーニングに使用することとした。一方で上記のうちTcf21の培養ポドサイトへの導入を試験的に行なったところ、免疫染色にて核に強い染色を認め、導入が成功していることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子のスクリーニングとツール作成にやや時間を要しているが、予備実験では全て技術的な問題はクリアされつつあるため
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は上記の遺伝子群を、ポドサイトに分化するとGFPを発現すると想定されるMefに導入し、ポドサイト分化に必須な遺伝子のスクリーニングを行う。In Vitroにてポドサイト分化が見られた場合、RNA-Seq法にて遺伝子発現プロファイルの検討を行い、また、ポドシンやネフリンなどポドサイト特異的蛋白のプロモーターのエピゲノムを解析する。さらに、細胞治療として、in vitroで作成したポドサイトをStreptozotocinによる糖尿病腎症マウスにcell transferし、尿蛋白の現象が見られるか否かを検討する。
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