Self-organization of elaborate digestive tract in the simple chordate

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17KT0023
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 西田 宏記 大阪大学, 理学研究科, 教授 (60192689)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小沼 健 大阪大学, 理学研究科, 助教 (30632103)
• Project Period (FY): 2017-07-18 – 2022-03-31
• Keywords: 器官形成 / 消化器官 / 形態形成 / 口形成 / オタマボヤ / 脊索動物

Outline of Annual Research Achievements

体内には様々な器官が３次元に配置されている。また、それぞれの器官自体も3Dの構造を持っている。しかし、複雑な形態が個体差なく作られるしくみの理解は遅れている。3D形態ができあがっていくしくみの解明には、4D (3D+t)ライブイメージングが不可欠である。ライブイメージングには、サンプルが小さく全ての過程が急速に起こる系が適している。本研究では、オタマボヤ（Oikopleura dioica）をその系として、５時間の間に起こる消化管の形態形成とその構築原理を解明することを目的とする。この系は解析に値する充分な複雑さを持つが、他の動物の消化管形成に比してとても単純化された系である。全ての過程は５時間程度で完了する。内臓の形態形成は自己組織化の例であり、オタマボヤでは62個の細胞の塊から口から、咽頭、胃、腸、肛門にかけて500個ほどの細胞でできている高度に組織化された内臓ができあがる。消化管の形態を創成するしくみの素過程として、４つの現象に注目してそのしくみを探る。器官境界の形成、上皮極性の形成、管腔形成、管腔の体外への開口、である。全ての過程は５時間程度で完了するので、包括的な解析に最適な系である。精力的に4D（3D+t）ライブイメージングを行い、多面的かつ大量のデータの取得を行った。データの取得は、微分干渉顕微鏡、デコンボルーション顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行った。また、体幹部の形態形成過程において核(H2B-mCherry)・細胞膜（PH-YFP）を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影した。オタマボヤの幼生は幅が40 ミクロン程であり完全に透明なので、核を光らせZスタックを撮る場合、幼生の上焦点面から下焦点面までの像を得ることができる。また、ゲノム配列やRNA-seqの遺伝子関係のデータも充実しており、これらのデータも最大限に活かして、研究を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

動物の発生における形態形成期の初期に、組織(器官)の境界形成が行われる。そこで、組織(器官)の境界形成のしくみにカドヘリンが関与すると考え、器官形成期におけるカドヘリン遺伝子群の発現を調べた。脊索動物のオタマボヤは、幼生が透明なので組織境界形成や形態形成を観察するのに適しており、受精後3時間で尾芽幼生として孵化する。その時期の体幹部には特に明瞭な組織境界はまだできていない。その後、２時間で組織の境界が見えるようになり、7時間で器官形成を全て完了する。
日本産ワカレオタマボヤのゲノム配列は決定した。まず、カドヘリン遺伝子を網羅的にリストアップし、19個の遺伝子をカドヘリン候補遺伝子群とした。リストアップしたそれぞれの遺伝子について、発生ステージごとの遺伝子発現量をstaged RNA-seqの結果を用いて調べた結果、組織境界形成が始まる孵化直後から発現量が上昇しているものが16遺伝子あった。よって、多種のカドヘリンの発現量が増加し始める時期と組織の境界形成が開始する時期が一致していることが分かった。これら16の遺伝に関して、器官形成期の様々なステージ（受精後3, 4, 5, 8時間）の幼生を用いてホールマウントin situハイブリダイゼーションによって発現部位を解析した結果、6パターンの組織特異的な発現が見られた。以上の結果をもとに、器官形成期におけるカドヘリン遺伝子群の発現について組織境界形成と関連付けて考察した。

Strategy for Future Research Activity

16種類のカドヘリンが組織境界形成に関わっている可能性が強く示唆されたので、今後は各カドヘリン遺伝子の機能阻害を順次RNAiなどを用いて行っていき、上記の仮説の機能的検証をおこなっていく。
また、これまでの成果で、受精後３時間から１０時間までの形態形成過程を3Dのライブタイムラプスイメージングで撮影した大量のデータを集積することができている。これらは、微分干渉顕微鏡像、核を蛍光で光らせたもの（細胞分裂のモニターに使える）、細胞膜を光らせたもの（細胞形態の観察に使える）である。これらの大量に取得されたデータをImageJ画像解析ソフトを用いて詳細に解析していく。現在までに、内胚葉と外胚葉がつながる口の部分の解析が終了しているが、その他の臓器の形態形成の解析はまだ進んでいない。今後は、これまで集めたデータを精力的に解析していき、オタマボヤにおける内臓の形態形成の原理を解き明かしていく予定である。

Causes of Carryover

昨年度はコロナ対策で大学や研究室の閉鎖が２ヶ月ほど行われ、また、その後の研究再開にも時間がとられた。これにより、当初の計画より研究が遅れ、次年度使用額が生じた。現在のところは、ほぼ通常どおりに研究を行うことができており、カドヘリンの機能阻害と画像解析を続行し、今年度で研究が終了できると予想している。

Research Products

• [Int'l Joint Research] パドバ大学(イタリア)
  • Country Name: ITALY
  • Counterpart Institution: パドバ大学
• [Int'l Joint Research] モンパリエ大学(フランス)
  • Country Name: FRANCE
  • Counterpart Institution: モンパリエ大学
• [Int'l Joint Research] 上海交通大学(中国)
  • Country Name: CHINA
  • Counterpart Institution: 上海交通大学
• [Journal Article] ANISEED 2019: 4D exploration of genetic data for an extended range of tunicates. (2020)
  • Author(s): Dardaillon, J., Dauga, D., Simion, P., Faure, E., Onuma, T.A., .............. , Nishida, H., Dantec, C., Lemaire, P.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 48 Pages: D668-D675
  • DOI: 10.1093/nar/gkz955
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein phosphatase 2A is essential to maintain meiotic arrest, and to prevent Ca2+ burst at spawning and eventual parthenogenesis in the larvacean Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Matsuo, M., Onuma, T.A., Omotezako, T., Nishida, H.
  • Journal Title: Dev. Biol. Volume: 460 Pages: 155-163
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2019.12.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A chordate species lacking Nodal utilizes calcium oscillation and Bmp for left-right patterning. (2020)
  • Author(s): Onuma, T.A., Hayashi, M., Gyoja, F., Kishi, K., Wang, K., Nishida, H.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 117 Pages: 4188-4198
  • DOI: 10.1073/pnas.1916858117
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A genome database for a Japanese population of the larvacean Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Wang, K., Tomura, R., Chen, W., Kiyooka, M., Ishizaki, H., Aizu, T., Minakuchi, Y., Seki, Yutaka Suzuki, M., Omotezako, T., Suyama, R., Masunaga, A., Plessy, C., Luscombe, N.M., Dantec, C., Lemaire, P., Itoh, T., Toyoda, A., Nishida, H., and Onuma, T.A.
  • Journal Title: Dev. Growth Differ. Volume: 62 Pages: 450-461
  • DOI: 10.1111/dgd.12689
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mouth opening is mediated by separation of dorsal and ventral daughter cells of the lip precursor cells in the larvacean, Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Morita, R., Onuma, T.A., Manni, L., Ohno, N., Nishida, H.
  • Journal Title: Dev. Genes Evol. Volume: 230 Pages: 315-327
  • DOI: 10.1007/s00427-020-00667-4
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Conservation of peripheral nervous system formation mechanisms in divergent ascidian embryos. (2020)
  • Author(s): Coulcher, J. F., Roure, A., Chowdhury, R., Robert, M., Lescat, L., Bouin, A., Cadavid, J. C., Nishida, H., and Darras, S.
  • Journal Title: eLIFE Volume: 9 Pages: e59157
  • DOI: 10.7554/eLife.59157
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] The larvacean Oikopleura dioica lacks Nodal and utilizes calcium oscillation and Bmp expression for left-right patterning. (2020)
  • Author(s): Takeshi A. Onuma, Momoko Hayashi, Fuki Gyoja, Kanae Kishi, Kai Wang and Hiroki Nishida
  • Organizer: 日本発生生物学会
• [Presentation] 脊索動物オタマボヤをもちいて左右形成の新しい領域を開拓する (2020)
  • Author(s): 小沼健、西田宏記
  • Organizer: 第５回ホヤ研究会
• [Presentation] マボヤの原腸陥入と単離内胚葉割球のブレブ形成活性について (2020)
  • Author(s): 西田宏記、西田遥香、児下未佳
  • Organizer: 第５回ホヤ研究会
• [Presentation] 動物繊維をもちいたオタマボヤの「ハウス」建築 (2020)
  • Author(s): 小沼 健、秋山 正和、山崎 慎太郎、近藤 滋、西田 宏記
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Invited
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/bio_web/lab_page/nishida/index.html