2017 Fiscal Year Research-status Report
脊椎動物・節足動物比較によるウイルス感染制御コアネットワーク探索
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17KT0045
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
松野 啓太 北海道大学, 獣医学研究院, 講師 (40753306)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 剛士 北海道大学, 獣医学研究院, 助教 (70709881)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2021-03-31
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| Keywords | RNAウイルス / 病原性 / ネットワーク解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、リフトバレー熱ウイルスのリバースジェネティクス系をテキサス大学より、連携研究者の協力のもとで移植した。核タンパク質（N）に対するポリクローナル抗体を作成し、蛍光抗体法により感染性を持つ組換えウイルスの産生を確認した。SFTSウイルスについてはウイルスタンパク質の強制発現系に加え、レポーター遺伝子を組み込んだSFTSウイルスRNAの発現系を確立し、ミニゲノムアッセイによりウイルスRNAの複製・転写効率の測定が可能となった。また、動物園でSFTSにより死亡したチーターから分離したウイルス株のHuh-7細胞における増殖性が、これまで用いてきたものよりも顕著に高かったため、株を変更してリバースジェネティクス系を確立する準備を整えた。
ウイルス感染細胞から抽出したRNAを用いて効率よくトランスクリプトーム解析するには、リボソームRNAを除去する必要がある。本年度は節足動物細胞におけるリボソームRNA除去技術の開発を行った。また、SFTSウイルスあるいはその類縁ウイルスを感染させた哺乳動物細胞を用いてトランスクリプトーム解析を行い、感染後にSFTSウイルス感染細胞では自然免疫関連遺伝子が類縁ウイルスとは異なる発現量となっていることを明らかにした。これは、ウイルスの病原性と宿主応答に関連があることを示している。また、SFTSウイルスの非構造タンパク質NSs、N、RNAポリメラーゼ（L）に対する抗体を樹立または分与を受け、各ウイルスタンパク質と結合する宿主タンパク質およびRNAの解析を行った。その結果、これまでに報告されている宿主因子以外にウイルスタンパク質と相互作用する因子を複数見いだすことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では平成２９年度は解析系の樹立と基礎データの蓄積と位置付けていた。その計画に従い、リフトバレー熱ウイルスのリバースジェネティクス系の移植ならびにSFTSウイルスのリバースジェネティクス系の樹立を推し進めた。SFTSウイルスリバースジェネティクス系は樹立できなかったが、想定の範囲内であり、リバースジェネティクス系以外のアッセイ系が樹立できたため、概ね順調に進んでいると評価できると考える。リバースジェネティクス系の確立はウイルス種ごとに難易度が異なるため、株を変更するなどの工夫をしながら引き続き樹立を試みるが、平成３０年度においては他のアッセイ系および組換えでない野外分離株を用いた実験によりデータを得る。
トランスクリプトーム解析については、SFTSウイルスを用いた検証を実施した。また、節足動物細胞における効率良い解析のために、その基盤となる技術を検証した。、また、インタラクトーム解析に向けたウイルスタンパク質強制発現系と、それらを認識する抗体の作成がほぼ完了した。一部の解析は前倒しで実施し、既報の現象との整合性を確認している。以上より、平成３０年度に予定している宿主因子探索に向けた準備が整ったと判断し、おおむね順調に進行しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３０年度には、引き続きSFTSウイルスのリバースジェネティクス系樹立を試みる。ウイルスタンパク質強制発現系については、リフトバレー熱ウイルスおよびSFTSウイルスだけではなく、類縁ウイルスのタンパク質発現系を準備し、より精度の高い比較解析ができるように準備を整える。また、タンパク質強制発現系については、SFTSウイルスの各タンパク質単独と、複数のウイルスタンパク質を組み合わせた強制発現では、細胞内局在等が異なるという報告（Tapiwa et al. 2017）があるため、できる限り多くのウイルスタンパク質およびRNAを発現させる系を検討する。
トランスクリプトーム・インタラクトーム解析については、平成２９年度にSFTSウイルスおよび類縁のダニ媒介性フレボウイルスと、哺乳動物細胞との組み合わせについて実施したので、平成３０年度にはそれ以外の組み合わせについても順次実施していく。また、蚊由来培養細胞以外に、サシチョウバエ由来培養細胞も入手したため、リフトバレー熱ウイルスに類縁のサシチョウバエ媒介性フレボウイルスについても検討することが可能となった。様々なウイルスと宿主の組み合わせでネットワーク解析の精度を高める。
以上のデータが得られた後に、ネットワーク解析により哺乳動物と節足動物の双方でウイルス増殖（あるいは増殖抑制）に必須の因子を見出し、いくつかの候補因子を得る。それらの候補については順次、強制発現、あるいはsiRNAによるノックダウン、CRISPR/Cas9によるノックアウトを試みながら、ウイルス増殖過程における役割を証明していく。
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| Causes of Carryover |
予定していたトランスクリプトーム解析の一部が、機械が使用可能でなかった時期があったために延期せざるをえなかったため。
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