In vivo patch法によるprestin導入再生内耳の直接的機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18390454
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 欠畑 誠治 弘前大学, 医学部, 助教授 (90261619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 伸哉 弘前大学, 医学部, 教授 (00312158) ; 丸屋 信一郎 弘前大学, 医学部附属病院, 助手 (90396408) ; 南場 淳司 弘前大学, 医学部附属病院, 助手 (50361027)
• Keywords: 内耳再生 / コルチ器 / 外有毛細胞 / prestin / ソノポレーション法 / 運動能

Research Abstract

目的:哺乳類における極めて鋭敏な音受容機構は、内耳における外有毛細胞(OHC)運動能がもたらす"蝸牛増幅機構"によっている。OHC運動能は、その細胞側壁に存在する細胞モーターであるprestinの変形によることが解明されつつある。内耳再生医療のメインターゲットは最も受傷性の高いOHC運動能の回復である。再生されたOHCが"蝸牛増幅機構"に及ぼす質的効果については全く検討されていない。本研究では、直接prestin遺伝子Presの形質導入したコルチ器細胞、特にprestin高発現OHCを用いて再生医療への応用のための機能的検討を行う。
結果:
1.正常マウスOHCのprestin発現量の決定
生後5日目(PS)から生後18日目(P18)までのC57BL/6JマウスOHCを用いてパッチクランプ法を行い、その膜容量の変化を測定し、さらに各日齢におけるprestin荷密度を算出した。電荷密度はP18でプラトーに達し、10,956e^-/μm^2であることがわかった。
2.Prestin遺伝子(Pres)の器官培養コルチ器への遺伝子導入
コルチ器内のOHCに、gerbilより同定したprestin遺伝子(Pres)を、マイクロバブル(診断用超音波造影剤)を併用してソノポレーション法にて遺伝子導入した。
3.コルチ器内prestin発現細胞の形態学的・生理学的解析
培養コルチ器組織よりRNAを抽出し、gerbilのprestin遺伝子配列に特異的なオリゴプライマーを用い、reverse transcription-PCRによってprestin遺伝子の導入の確認を行った。発現ベクターにGFP遺伝子を挿入したprestin遺伝子導入24時間後にレーザー顕微鏡にて、内・外有毛細胞・支持細胞の列と一致する部位にGFPの蛍光を確認した。現在、prestin遺伝子導入後のOHCを用いて、パッチクランプ法にてprestin発現量の解析を試みている。