クロマグロの養殖技術確立の基盤となる免疫機能の基礎的解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18580199
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: National Fisheries University
• Principal Investigator: 稲川 裕之 独立行政法人水産大学校, 生物生産学科, 助教授 (30399662)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 幸則 独立行政法人水産大学校, 生物生産学科, 教授 (70399658) ; 近藤 昌和 独立行政法人水産大学校, 生物生産学科, 講師 (70399666) ; 澤田 好史 近畿大学, 水産研究所, 助教授 (80319764) ; 河内 千恵 徳島文理大学, 健康科学研究所, 特別研究員 (00274142)
• Keywords: クロマグロ / 免疫 / 養殖 / 腫瘍壊死因子 / TNF

Research Abstract

養殖クロマグロの出荷のために生け簀から船上に取り上げる時に頭腎を採取した。これら組織サンプルは船上でRPMI1640培地に入れ、氷で冷却した。血液はヘパリンを入れたシリンジを用いて採取し、氷中で冷却した。サンプル採取から1時間以内に、細胞単離操作を開始した。パーコールを用いて白血球と赤血球を分画し、生存率95%以上の1×10^7以上の白血球細胞を得ることが可能であった。好中球や単球を分離する条件は見いだせなかったので、以後実験には白血球画分を使用することにした。クロマグロの免疫状態を評価する指標として、腫瘍壊死因子(TNF)を用いることにした。そのために、クロマグロのTNF遺伝子クローニングを行った。アユ、タイ、ヒラメ等のTNFのアミノ酸配列の保存性の高い部分からdegenerative primerを作製し、PCRを行ったところ、予想サイズのPCRプロダクトが電気泳動で確認されたので、この産物をTAクローニングベクターにサブクローニングし、DNA配列を解析した。その結果、魚類のTNFとホモロジーのある遺伝子産物を同定したので、これに基づきRACE法を行い、全鎖長のクロマグロTNF遺伝子ホモログのクローニングに成功した。クロマグロの各組織(エラ、肝臓、血球、腸、頭腎、脾臓、心臓、心臓、卵巣)でのTNF遺伝子発現量をリアルタイムPCRで定量(EF-1を基準)を検討したところ、各組織(n=3-6)の発現量に有意差が無く、同等の発現量であった。以上の事から、クロマグロのTNF遺伝子はタイ、ヒラメ、コイ等とことなり、各組織に均一に発現していることが明らかとなった。