植物細胞の内と外を結ぶ物質輸送システムはいかに獲得されたか

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02470
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 上田 貴志 基礎生物学研究所, 細胞動態研究部門, 教授 (10311333)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 細胞膜 / 分泌経路 / エンドサイトーシス経路 / ANTH / RAB / SNARE

Outline of Annual Research Achievements

細胞内と細胞外のインターフェイスとして機能する細胞膜の機能発現には、細胞膜タンパク質の量や局在の厳密な制御が必須である。そこでは分泌経路とエンドサイトーシス経路が高度に協調して機能しており、一つ一つの細胞膜タンパク質に固有の量や局在の制御を実現している。一般に、真核生物の膜交通では、進化的に高度に保存された分子群が機能していることが知られている。RAB GTPaseやSNAREはその代表的なものであり、全ての単膜系オルガネラ間輸送でこれらの分子が機能していることが知られている。一方で、それぞれの生物に特有の体制や生理機能を反映し、膜交通経路も生物ごとに多様化していることも明らかになっている。
膜交通経路の多様化には、そこで機能する鍵因子群の機能的多様化が介在したと考えられる。本研究では、植物細胞の内と外とを隔てる細胞膜の機能発現の背景に潜む、植物に独自の分泌経路およびエンドサイトーシス経路の制御機構を明らかにする。そのため、分泌経路とエンドサイトーシス経路で機能する分子の中から、植物の進化の過程で独自の多様化を果たした分子群に注目し、その機能解析を推進している。2019年度には、シロイヌナズナのANTHドメインタンパク質の中でもANTH1のメンバーに注目し、その機能解析を進めた。その結果、ANTH1が植物の正常な発生に必要であることや、クラスリン分子と結合することを見いだした。さらに、ANTH1と相互作用する分子として、分泌小胞と細胞膜の融合を実行するSNAREであるVAMP72を見いだした。さらに、ゼニゴケゲノム中のANTHタンパク質をコードする遺伝子を全て単離し、その発現場所や細胞内局在の解析も進めている。
RAB GTPaseについても、RAB11とRAB8が構築するRAB カスケードの存在を証明するべく、RAB11と相互作用するSCD複合体の解析を進めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

シロイヌナズナのPICALM1aおよびPICALM1bの機能解析を進めた。これらのタンパク質はシロイヌナズナの全身で発現しており、主に細胞膜への局在が観察された。これらの単独変異体では異常な表現形は見られなかったが、二重変異体を作出したところ半矮性の表現形を示したことから、PICALM1グループがシロイヌナズナの正常な発生に必要であることが示された。また、蛍光タンパク質を連結したPICALM1aがクラスリンと相互作用することを、共免疫沈降法により確認した。さらに、VAMP72がPICALM1と相互作用することも突き止めた。VAMP72は主に分泌小胞に局在するR-SNAREで、細胞膜上のQ-SNAREと複合体を形成することにより分泌小胞と細胞膜の融合を実行する分子である。野生型では、膜融合の実行後VAMP72は速やかに細胞膜から回収され、トランスゴルジネットワーク（TGN）や分泌小胞へと運ばれるが、picalm1二重変異体では、VAMP72が細胞膜に蓄積する様子が観察された。これらの結果から、PICLAM1がVAMP72を細胞膜から回収する際、クラスリン被覆小胞への積み込みを担うアダプターとして機能することが明らかになった。
ゼニゴケゲノムにコードされる３つのANTHドメインタンパク質についても解析をおこなった。そのうちPICALM-Aは、葉状体のメリステム付近の細胞では細胞膜とTGNに局在し、さらに細胞板にも強く局在した。さらに油体細胞においては、油体膜に強く局在することから、油体膜が細胞膜と同様にクラスリン介在型エンドサイトーシスの場であることが示された。
シロイヌナズナの分泌経路において、RAB11-RAB8カスケードで機能すると考えられるSCD複合体の解析も進めた。共免疫沈降に続く質量分析解析により、SCD複合体と協調して機能する分子の候補を単離した。

Strategy for Future Research Activity

2019年度に明らかにしたシロイヌナズナPICALM1の機能については、2020年度中の論文発表を目指す。さらにPICALMファミリー内の機能分化に関する知見を得るため、他のPICALMメンバーについても遺伝学的、細胞生物学的な解析をおこなう。既にPICALM9の解析に着手しており、他のメンバーについても順次解析をおこなう。ゼニゴケのANTHドメインタンパク質については、３つの全てのPICALMメンバーについて既に解析に着手している。上述のPICALM-Aに続き、雄性生殖器で特異的な発現が見られるPICALM-Kについて重点的に機能解析をおこなう。PICALM-Kは、他のPICALMメンバーには無いキナーゼドメインを有することから、ANTHドメインタンパク質の新機能化のモデルとなることも期待している。
RAB11-RAB8カスケードについては、全反射顕微鏡による観察をさらに進めるとともに、SCD複合体がカスケードでどのような役割を担っているのかを生化学的および遺伝学的な解析により明らかにする。また、SCD複合体の相互作用因子候補をすでに複数単離しており、これらの機能解析を通して、植物におけるRAB11-RAB8カスケードの存在の証明と分泌経路における役割を明らかにすることを目指す。

Research Products

• [Journal Article] Deep Imaging Analysis in VISUAL Reveals the Role of YABBY Genes in Vascular Stem Cell Fate Determination (2020)
  • Author(s): Nurani, AM., Ozawa, Y., Furuya, T., Sakamoto, Y., Ebine, K., Matsunaga, S., Ueda, T., Fukuda, H. and Kondo, Y.
  • Journal Title: Plant Cell Phys. Volume: 61 Pages: 255-264
  • DOI: https://doi.org/10.1093/pcp/pcaa002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A whole-cell electron tomography model of vacuole biogenesis in Arabidopsis root cells (2019)
  • Author(s): Cui, Y., Cao, W., He, Y., Zhao, Q., Wakazaki, M., Zhuang, X., Gao, J., Zeng, Y., Gao, C., Ding, Y., Wong, H.Y., Wong, W.S., Lam, H.K., Wang, P., Ueda, T., Rojas-Pierce, M., Toyooka, K., Kang BH. and Jiang L.
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 59 Pages: 95-105
  • DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-018-0328-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A Golgi-released subpopulation of the trans-Golgi network mediates constitutive and pathogen-inducible protein secretion in Arabidopsis (2019)
  • Author(s): Uemura, T., Nakano, T.R., Takagi, J., Wang, Y., Kramere, K., Finkemeier, I., Nakagami, H., Tsuda, K., Ueda, T., Schulze-Lefert, P. and Nakano, A.
  • Journal Title: Plant Phys. Volume: 179 Pages: 519-532
  • DOI: https://doi.org/10.1104/pp.18.01228
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enrichment of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the extra-invasive hyphal membrane promotes Colletotrichum infection of Arabidopsis thaliana (2019)
  • Author(s): Shimada, T.L., Betsuyaku, S., Inada, N., Ebine, K., Fujimoto, M., Takano, Y., Fukuda, H., Nakano, A. and Ueda, T.
  • Journal Title: Plant Cell Phys. Volume: 60 Pages: 1514-1524
  • DOI: https://doi.org/10.1093/pcp/pcz058
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Marchantia polymorpha, a New Model Plant for Autophagy Studies (2019)
  • Author(s): Norizuki, T., Kanazawa, T., Minamino, N., Tsukaya, H. and Ueda, T.
  • Journal Title: Front. Plant Sci. Volume: 10 Pages: 935
  • DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00935
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The RopGEF KARAPPO is Essential for the Initiation of Vegetative Reproduction in Marchantia polymorpha (2019)
  • Author(s): Hiwatashi, T., Goh, HZ., Yasui, Y., Koh, LQ., Takami, H., Kajikawa, M., Kirita, H., Kanazawa, T., Minamino, N., Togawa, D., Sato, M., Wakazaki, M., Yamaguchi, K., Shigenobu, S., Fukaki, H., Mimura, T., Toyooka, T., Sawa, S., Yamato, KT., Ueda, T., Urano, D., Kohchi, T. and Ishizaki, K.
  • Journal Title: Curr. Biol. Volume: 29 Pages: 3525-3531.e7
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.08.071
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protamines from liverwort are produced by posttranslational cleavage and C-terminal di-aminopropanelation of several male germ-specific H1 histones (2019)
  • Author(s): D'Ippolito, RA., Minamino, N, Rivera-Casas, C., Cheema, MS, Bai, DL., Kasinsky, HE., Shabanowitz, J., Eirin-Lopez, JM., Ueda, T., Hunt, DF., and Ausio, J.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 未定 Pages: －
  • DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010316
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RAB GTPases and their effectors in plant endosomal transport (2019)
  • Author(s): 1)Minamino, N. and Ueda, T.
  • Journal Title: Curr. Opin. Plant Biol. Volume: 52 Pages: 61-68
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.pbi.2019.07.007
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Organelle functions and membrane trafficking in plant cells (2019)
  • Author(s): Takashi Ueda
  • Organizer: EMBO practical course
  • Int'l Joint Research / Invited