2018 Fiscal Year Annual Research Report

Development of recombinant genital herpes vaccine based on the live attenuated rotavirus vaccine

Research Project

Project/Area Number	18H02784
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	吉川哲史藤田医科大学, 医学部, 教授 (80288472)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	井平勝藤田医科大学, 保健学研究科, 教授 (10290165) 三浦浩樹藤田医科大学, 医学部, 助教 (10751761) 東本祐紀藤田医科大学, 医療科学部, 助教 (20569701) 谷口孝喜藤田医科大学, 医学部, 名誉教授 (40094213) 河本聡志藤田医科大学, 医学部, 講師 (60367711) 菅田健藤田医科大学, 医学部, 講師 (60454401)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ロタウイルス / 性器ヘルペスワクチン / リバースジェネティックス / リコンビナントワクチン
Outline of Annual Research Achievements	【具体的内容】過去のHSV-2ワクチンで候補遺伝子として使用されているgD2を最初に選択した。約900bpのgD塩基配列をベクターへ組み込むために、制限酵素サイトで挟んだgD2発現用塩基配列を人工合成しSA11のNSP-1プラスミドにサブクローニングした。gD組み込みNSP-1プラスミドを含んだ全11種類のSA11遺伝子分節を組み込んだプラスミドを用い、ロタウイルスリバースジェネティクスシステムによりHSV-2 gD組み込みSA11(rSA11-gD2)を作製した。rSA11-gD2のHSV-2 gD蛋白発現をin vitroで確認するため、CV1細胞にrSA11-gD2を感染させ、感染細胞の培養上清を用いてWestern blottingにてHSV-2 gD蛋白の発現を確認した。　次に、In vivoでの免疫原性を確認するため、雌BALB/cマウスに5日齢、19日齢の計2回rSA11-gD2を経口接種した。1回目接種後の下痢スコアは野生株SA11感染マウスと同一で、Mock感染より有意に高値だった。2回目接種後4週間の47日齢に血清を採取し中和抗体法を行ったが、4倍希釈血清中の中和抗体は陰性だった。【意義と重要性】マウスロタウイルスリバースジェネティックス系を用いて、HSV gD2タンパクを発現するロタウイルスの構築に成功した。これまでの研究成果と同様、NSP1領域にHSV由来外来遺伝子を挿入してもウイルスの増殖能に影響はなく、今後の組み換えワクチン作成のための重要な知見と考える。【今後の研究の展開】今後より免疫応答が強いと考えられる成熟マウスを用いて免疫原性の確認を行うとともに、接種ウイルス量を増量する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ロタウイルスに組み込むHSV-2遺伝子として、細胞内へのエントリーに必要な糖タンパクであり感染防御抗原でもあるgD、補体の不活化やIgG結合能を有し宿主免疫制御にかかわるgC、gEおよびgI、そして神経病原性因子であるICP34.5を候補とした。最初の組み込み遺伝子として、過去のHSV-2ワクチンで候補遺伝子として使用されているgD2を選択した。約900bpのgD塩基配列をベクターへ組み込むために制限酵素サイトで挟んだgD2発現用塩基配列を人工合成し、この制限酵素サイトを用いてSA11のNSP-1プラスミドにサブクローニングした。その他の候補遺伝子も同様の方法でサブクローニングし、既にプラスミドの作成を終えている。gD組み込みNSP-1プラスミドを含んだ全11種類のSA11遺伝子分節を組み込んだプラスミドを用い、ロタウイルスリバースジェネティクスシステムによりHSV-2 gD組み込みSA11(rSA11-gD2)を作製した。rSA11-gD2のHSV-2 gD蛋白発現をin vitroで確認するため、CV1細胞(アフリカミドリザル、腎臓細胞)にrSA11-gD2を感染させ、感染細胞の培養上清を用いてWestern blottingにてHSV-2 gD蛋白の発現を確認した。次に、In vivoでの免疫原性を確認するため、雌BALB/cマウスに5日齢及び19日齢の計2回rSA11-gD2を経口接種した。1回目接種後の下痢は野生株SA11感染マウスと有意差なく発症していた。2回目接種後4週間の47日齢に血清を採取し中和抗体法を行ったが、4倍希釈血清において中和抗体は陰性であった。
Strategy for Future Research Activity	1．より高力価のHSV-2 gD組み込みSA11(rSA11-gD2)を作成する。 2．成熟マウスを用いて免疫原性を評価する。 3．接種回数を2回から3回に増やす。 4．他の候補遺伝子組み込んだ、組み換えSA11株を作成する。