2018 Fiscal Year Annual Research Report
節足動物媒介ウイルスの特異な感染現象を反映したゲノム改変型宿主細胞の開発
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18H02856
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
伊澤 晴彦 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 室長 (90370965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
駒形 修 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 主任研究官 (20435712)
沢辺 京子 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 部長 (10215923)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 節足動物媒介性ウイルス / 宿主細胞 / ゲノム科学 / ゲノム編集 / バイオインフォマティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウイルス媒介節足動物由来の新規培養細胞系の樹立を目的として、デング熱・ジカウイルス感染症等の媒介蚊であるネッタイシマカ（西アフリカ産）およびヒトスジシマカ（日本産）、および重症熱性血小板減少症候群（SFTS）等の媒介種と考えられているフタトゲチマダニ（日本産）の胚子を用いた初代培養を試みた。具体的には、それぞれの産下卵を表面殺菌した後、切断あるいは圧潰したものを用いて初代培養を開始した。培養開始から数か月後、一部の組織片から細胞の遊出が認められ、これらの細胞集団の培養を継続して細胞株化を進めている。
日本脳炎の主要媒介蚊であるコガタアカイエカ由来のNIID-CTR細胞において発現しているmRNAについてRNAseq解析を行った。アセンブリによって得られた転写物の配列のほとんどは、現行のNIID-CTR細胞のゲノムアセンブリにマッピングされた。これらの転写物の中には、ウイルスの侵入・増殖・抑制に関わっている因子が含まれている可能性があり、今後の研究に有用な情報であると考えられる。
脊椎動物側の検討については、ヒト由来Huh7.5.1-8細胞とウイルス許容性の高いアフリカミドリザル由来Vero細胞を用い、各種節足動物媒介ウイルス感染感受性を比較検討した結果、Huh7.5.1-8細胞の方が、高ウイルス産生能を示し、細胞変性効果も高かった。このことから、Huh7.5.1-8細胞は、Vero細胞より節足動物媒介ウイルスの産生・分離や、検出に有用であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
西アフリカ産ネッタイシマカおよび日本産ヒトスジシマカ、および日本産フタトゲチマダニの胚子を用いた初代培養を試みた結果、それぞれの組織片の一部から細胞の遊出が確認され、緩やかな増殖が認められた。このうちネッタイシマカとヒトスジシマカ由来細胞については、継代数がそれぞれ20代、10代を超え、ほぼ安定して継代維持できるまでになった。
コガタアカイエカ由来NIID-CTR細胞においてmRNAseq解析を行い、この細胞株において発現するタンパク遺伝子配列の情報を得ている。また、既知のタンパク配列データベースを用いてアノーテーションを行い、それぞれの遺伝子の機能について推定を行った。今後、ウイルスの侵入・増殖・抑制に関わっている因子に関してさらなる探索を行う。
樹立したヒト由来Huh7.5.1-8細胞とウイルス許容性の高いことが知られるアフリカミドリザル由来Vero細胞とで、各種節足動物媒介ウイルス感染感受性を比較検討した結果、Vero細胞よりHuh7.5.1-8細胞の方が、ウイルス産生量が高く、細胞変性効果も強かった。Huh7.5.1-8細胞は、節足動物媒介ウイルスの産生・分離や、検出に非常に有用であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
デング熱・ジカウイルス感染症等の媒介蚊種、およびSFTS等の媒介マダニ種由来の胚子を用いた初代培養により得られた増殖性のある細胞集団をもとに、細胞株化に向けた継代培養を続ける。またこれら初代培養細胞の各種節足動物媒介性ウイルスに対する感受性等の性状解析を行う。
コガタアカイエカ由来NIID-CTR細胞で発現していない遺伝子に関してエビデンスに基づいた正確な遺伝子アノーテーションを行うため、コガタアカイエカ飼育個体の各発生段階についてRNAseq解析を行う。また、これらのデータを培養細胞の遺伝子発現パターンと比較し、細胞不死化のメカニズムを明らかにする。NIID-CTR細胞ゲノムアセンブリについて染色体レベルのゲノムマップを得る目的で、Hi-C法によるスキャホールディングを行う。将来の効率的なゲノム編集、遺伝子組換え等の技術確立を目的として、NIID-CTR細胞の遺伝子発現データから高発現プロモーターの候補をリストアップする。
ウイルス許容性の高いサル由来Vero細胞と、ヒト由来Huh7.5.1-8細胞の全ゲノム情報をもとに、感染許容性に関与しうる遺伝子候補を絞り込む。得られた候補遺伝子や自然免疫系に関わる遺伝子を破壊または過剰発現させることで、各種節足動物媒介性ウイルスに対する感受性・増殖性の変化を調べる。
また、ヒト由来HeLa細胞系よりウイルス感受性・許容性の異なる株が分離されたため、これらの細胞株の遺伝子発現情報を比較検討することで、感受性・許容性に関わる候補遺伝子を絞り込む。得られた候補遺伝子を破壊または過剰発現させることで、各種節足動物媒介性ウイルスに対する感受性・増殖性の変化を調べる。
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