2018 Fiscal Year Annual Research Report

増殖型レトロウイルスを用いた遺伝子治療を応用した膵癌の新規治療戦略

Research Project

Project/Area Number	18H02876
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	平野聡北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	七戸俊明北海道大学, 医学研究院, 准教授 (70374353) 土川貴裕北海道大学, 大学病院, 講師 (50507572) 中村透北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796) 平岡圭北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (10719587)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	膵癌 / 新規遺伝子治療
Outline of Annual Research Achievements	5FUならびにRRVシステムが腫瘍微小環境に与える変化を解析した。PBF投与と比較し、5FUでは、GM-CSF, IL6, TNFαが上昇し、RRVシステムでも同様の傾向がみられた。免疫系が保存されたマウス膵癌同所移植モデル(orthotopic tumor model)を用い、RRVシステムによる治療群と5FU投与による治療群において、血中と腫瘍微小環境を評価した。CTL assayを施行し、細胞障害性リンパ球（CD4,CD8）はRRVシステムによる治療群で増加する傾向が示された。腫瘍切片の免疫染色ではRRVシステムによる治療群で免疫記憶細胞(CD45O, CD45RA)の免疫記憶細胞(CD45O, CD45RA)の腫瘍内増殖が観察されたが、抑制性免疫細胞（Treg,MDSC)、に変化はなかった。長期間の免疫記憶状態を定量的に評価する目的で、マウス膵癌orthotopic tumor modelを作成した。現在、経時的なセントラルメモリーＴ細胞やエフェクターメモリーＴ細胞の変化を解析し、ELISPOTアッセイを用いたIFN-ganma 産生細胞の変化を検証している。またxCELLigenceリアルタイム細胞解析による免疫細胞の変化を検証している。経時的にデータ解析を開始したところで、今後結果を集積する予定である。 K-RASを不活性化する新規RRVシステムの開発に関して、RRVにDominant negative RAS変異体（N116Y/C-del2）を搭載した治療実験を行うため、DN-RAS(N116Y)プラスミドを作成し、サブクローニングを施行した。RRVシステムでのウイルス産生のためHEC293T細胞にトランスフェクションし、N116Yの産生能を評価したが、十分なウイルス量を得られなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason K-RASを不活性化する新規RRVシステムの開発に関しては、N116Y/C-del2によるHost cellへの作用（細胞障害）によるウイルス産生量の低下に起因すると考えられ、Host cellの変更が必要であるが、もともと次年度に行う実験を先んじて施行している経緯もあり、実験全体の進捗は順調と考える。
Strategy for Future Research Activity	(1)長期間の免疫記憶状態における定量的に評価を継続し、結果をまとめる。 (2)RRVシステムとCPT-11およびL-OHPとの併用療法を開始する。膵癌細胞にRRVシステムとCPT-11またはL-OHPのコンビネーションによる効果をisoeffect analysisを用いて検討する(Chou,T.C, J. Natl. Cancer Inst.1994)。同方法はCPT-11とL-OHPのcombination の評価に使用された(Zeghari-Squalli N, Clin Cancer Res. 1999)。またマウス膵癌orthotopic tumor modelを用い、RRVシステムによる治療群と5FU投与による治療群において、L-OHPまたはCPT-11の上乗せ効果について検討する。3剤の併用療法となるが、いずれも、5FUとRRVプロドラッグシステムの2群をベースとし、併用療法の腫瘍縮小効果と副作用について検討を行う。 (3)K-RASを不活性化する新規RRVシステムの開発については、十分なウイルス量を得られなかったことから、Host cellを検討し、至適なウイルス産生細胞を検索する。またRRVシステムに代わる、on off switchを持つシステムへの導入を検討する。